[发明专利]壳聚糖酶CHI3、其编码基因及其制备方法

说明书

本发明公开了壳聚糖酶CHI3、其编码基因及其制备方法，所述壳聚糖酶CHI3具有如Seq ID No:1所示的氨基酸序列，属于壳聚糖酶GH46家族。上述壳聚糖酶的编码基因具有如Seq ID No:2所示的核苷酸序列。生产上述壳聚糖酶的方法包括以下步骤：在适合与所述壳聚糖酶生产的条件下，对上述能表达壳聚糖酶的培养物进行发酵，并对发酵产物进行分离和纯化，得到壳聚糖酶。本发明提供的壳聚糖酶的活性高、稳定性高，可通过工程菌发酵进行该酶的大批量生产，以便于将该壳聚糖酶应用于工业化寡聚糖生产中，将普遍存在的低成本的壳聚糖降解为更具应用价值的寡聚糖。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种壳聚糖酶CHI3、其编码基因及其制备方法。

背景技术

壳聚糖 (chitosan)，又名甲壳胺、脱乙酰甲壳素等，甲壳素的主要来源是节肢动物的表皮和软体动物的壳，也存在于真菌、细菌、低等藻类的细胞壁中。几丁质还是除蛋白质外含氮量最高的有机再生资源，其储量的丰富程度仅次于纤维素。但是由于甲壳素分子量大、不溶于水而不能被有效开发利用，造成了巨大的资源浪费。壳寡糖 (oligochitosan)是壳聚糖经过物理、化学降解或酶法降解生成的聚合度为2-20的低聚糖。与壳聚糖相比，壳寡糖分子量低，作为一种功能性低聚糖在医药、食品、化妆品和农业等领域有着非常广泛的应用。在医药方面，如：降低胆固醇、抗肿瘤、降血压、治疗烧、烫伤、止血、免疫调节、调节肠道菌群等；在食品应用方面，如：抑菌作用，直接作为保健食品、功能性食品添加剂、食品保鲜剂和防腐剂等；此外，还可在化妆品和农业方面进行应用。由于壳聚糖的许多独特功能只有被降解为壳寡糖才会显现出来。因此，选择高效降解壳聚糖的方法十分关键。

目前，甲壳低聚糖和壳低聚糖的制备大致分为化学法、生物法和物理法。由于物理法、化学法在生产过程中会产生大量废水、废物，还会消耗大量水资源，不符合国家节能减排的政策针。从环保、节能、高效的角度出发，生物酶法降解壳聚糖制备壳寡糖具有物理法和化学法无法比拟的优点酶法降解条件温和，且水解过程和产物分布容易控制，无污染，已经成为人们研究的热点。

壳聚糖酶的来源广泛，在细菌、真菌、蓝细菌、病毒和植物中都有发现，并且研究者们相继从多种微生物中分离得到壳聚糖酶，如WangS，ChaoC等人于2009年筛选出的Bacillus cereus TKU006产几丁质酶活力仅为0.14U/mL，夏祥在《产壳聚糖酶/甲壳素酶菌株的选育、发酵及壳聚糖酶分离纯化与酶学性质研究》中利用透明圈法从污水处理厂废水中筛选出活力最高的菌株Bacillus cereusHMX-21，其活力仅为0.56U/mL，WangS, TsengW等于2011年筛选出的产壳聚糖酶菌株Acinetobacter calcoaceticusTKU024，粗酶液最大活力为0.39U/mL。胡远亮等《产壳聚糖酶菌株的筛选与鉴定》公开了一种从土壤样品中筛选出的酶活力最高的一株Mitsraria，其酶活力仅为0.729μ/mL。

由于常规的菌株筛选不仅工作量极大，并且该方法会漏掉大量的基因信息，巨大的微生物基因资源无法被挖掘和充分利用，难以获得新颖度高的壳聚糖酶基因，而宏基因组方法，从新的角度更全面的进行基因筛选，有望获得新颖的、活力更高的壳聚糖酶，基于宏基因组的文库筛选可以避免常规方法的不足，有利于挖掘新基因和产生新的蛋白质。但是，目前还未出现有研究通过宏基因组文库构建筛选方法获得新的高应用价值的壳聚糖酶。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种基于宏基因组文库和功能筛选方法筛选得到的全新的、高活性的壳聚糖酶CHI3及其编码基因，这种壳聚糖酶属于糖苷水解酶GH46家族，热稳定性和pH稳定性高，可广泛应用于寡聚糖生产中。本发明还提供了可大量表达这种壳聚糖酶的工程菌和该酶的生产方法，可利用该类工程菌进行工业发酵，大批量的生产壳聚糖酶CHI3。

本发明的技术方案如下：