[发明专利]一种牛支原体Mbov_0274基因突变株及其应用

说明书

本发明公开了一种牛支原体Mbov_0274基因突变株，属于动物传染病防治技术领域，所述突变株命名为牛支原体(Mycoplasma bovis)T9.202，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2020084，所述Mbov_0274基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示。本发明通过qRT‑PCR检测T9.202株刺激BoMac细胞表达IL‑8的能力，结果显示牛支原体菌株T9.202诱导BoMac细胞表达细胞因子的能力下降，可望在牛支原体免疫防治领域发挥重要作用。

技术领域

本发明属于动物传染病防治技术领域，具体涉及到一株牛支原体Mbov_0274基因突变株，该突变株诱导巨噬细胞表达IL-8细胞因子的能力降低，在制备牛支原体疫苗方面具有应用潜力。

背景技术

牛支原体(Mycoplasma bovis,M.bovis)属于古柔膜体纲(Mollicutes)，支原体目(Mycoplasmatles)，支原体科，支原体属，是一种危害养牛业发展的重要病原，在世界范围内广泛存在，可以感染任何年龄段的牛，其发病多与运输应激相关，多数情况下表现为慢性肺炎和关节炎等。泌乳奶牛主要表现为牛支原体乳腺炎，犊牛经乳汁感染患牛支原体肺炎和关节炎。随着临床上抗生素耐药性增加，牛支原体病的防治已经是规模化养牛场面临的迫切难题，而这一问题的解决依赖于新药和新疫苗的开发。但是牛支原体致病机制不清楚严重阻碍新药和新疫苗的开发，进而阻碍牛支原体病的有效防控和治疗。

利用转座子构建突变体库已经在多种支原体中得到应用，主要为Tn916和Tn4001及其衍生而来的转座子。在鸡毒支原体中，Tn916和mini-Tn4001转座子被成功用于构建分别含有424和738个菌株的突变体库，并用于生物被膜形成相关基因的筛选(Wang et al2017,Whetzel et al 2003)。含有mini-Tn4001转座子的pMT85载体被用于构建微小脲原体突变体库(Aboklaish et al 2014)。在无乳支原体中，利用mini-Tn4001转座子诱变系统构建的突变体库被用于筛选细胞共培养生长相关基因及在宿主体内定植和扩散相关基因(Baranowski et al 2014,Baranowski et al 2010)。

本发明运用随机转座子突变技术构建了牛支原体Mbov_0274基因的突变株，并通过与牛巨噬细胞互作研究来鉴定诱导炎性细胞因子能力降低，从而提示该突变株可望作为疫苗开发，运用于牛支原体免疫防治领域。

发明内容

本发明的目的在于提供一株突变Mbov_0274基因的牛支原体菌株，该菌株诱导巨噬细胞表达IL-8细胞因子的能力降低，因此可望作为疫苗株在牛支原体免疫防治领域发挥重要作用。

其技术思路是：申请人以牛支原体HB0801(GenBank上的登录号为CP002058)为亲本菌株，利用PEG介导的转化方法，将含有转座子的pMT85质粒转化到牛支原体中，利用庆大霉素做抗性筛选标记，成功构建了牛支原体突变体库。通过对突变菌株进行大量筛选，最终从突变体库中成功鉴定出一株Mbov_0274基因突变株，转座子插入位点位于牛支原体HB0801基因组315328位点后，位于Mbov_0274基因的1664位点后。Western blot验证了该突变株的MbovP0274蛋白表达缺陷。申请人将该突变株命名为牛支原体T9.202，Mycoplasmabovis T9.202，于2020年4月27日保藏于湖北省武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M2020084。最后，使用qRT-PCR技术检测了突变株感染牛巨噬细胞后细胞因子的表达量，结果显示T9.202菌株相比野生毒力株HB0801和致弱株HB0801-150.2诱导巨噬细胞表达IL-8的能力显著降低，提示是一种毒力致弱株，有作为疫苗株开发应用的潜力。

更详细的技术方案参见《具体实施方式》所述。

附图说明