[发明专利]一种肺炎支原体等温扩增快速检测的特异性引物及侧流层析检测方法

说明书

本发明公开了一种肺炎支原体等温扩增快速检测的特异性引物，主要解决现有环介导恒温扩增技术检测临床肺炎支原体的技术存在核酸扩增反应耗时长的问题。本发明包括引物F3、B3、FIP、BIP、LoopF、LoopB，所有引物的序列分别如下：F3：TTGACACCAACGAACAGAGB3：TTGGTCAACACATCAACCTTFIP：TGACTGGAGGCCGTTAACGTTCAGGTCAATCCGAATBIP：GTGTTGCCGTTAGCGATAATGGCAAGTCCTAAGGTAACLoopF：CAGTGGTAAGAAGTCACCGTTLoopB：CCTATTGTTGTGATTGTGCTCAG。同时，根据上述特异性引物，本发明还提供了基于等温扩增的肺炎支原体侧流层析检测方法。通过上述方案，本发明不仅大幅缩短了核酸扩增反应的时间，而且能快速、有效地实现核酸检测，从而为支原体肺炎患者的准确诊疗提供了强有力的帮助，并且其检测效率高、成本低廉的特点也非常适合基层使用，因此具备大规模推广应用的条件。

技术领域

本发明涉及核酸扩增技术领域，具体涉及的是一种肺炎支原体等温扩增快速检测的特异性引物及侧流层析检测方法。

背景技术

肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae，Mp)是呼吸道感染最常见的致病菌之一，是引起原发性支原体肺炎(MPP)的病原体。Mp由于体积小，其通常通过飞沫传播，疾病流行因季节、性别、年龄、地区的不同而不同，但其感染在全球呈上升趋势。

目前，据不完全统计，MP所引起的肺炎占所有社区获得性肺炎的比例高达40％，且容易在儿童中引起爆发流行。MP不仅可引起发热、咳嗽等急慢性呼吸道感染症状，部分患者可因感染肺炎支原体而患哮喘，亦可引起中枢神经系统、关节等一系列肺外系统疾病，严重的可导致死亡。

由于肺炎支原体感染的临床症状并不典型，无法与其他肺炎相区别，且Mp缺乏细胞壁，常用的抗生素如β-内酰胺类等药物的治疗效果不明显，因此支原体肺炎的诊断主要靠实验室检测，常用的方法包括：金标准支原体培养、血清学方法(IgM和IgG)及分子诊断方法(以核酸PCR扩增为主)，其中：

支原体培养：(1)由于支原体生长缓慢，培养时间较长，因而通常需要数天至数周；(2)对操作者技术要求较高；(3)敏感性较差，培养阳性率低。

血清学方法：(1)特异性较差，有可能出现假阳性；(2)通常需要急性期和恢复期双份血清才能确诊；(3)样本周转时间较长，可能会影响临床的诊断及治疗；(4)部分病人IgM抗体持续阴性或者IgG抗体持续增高会影响诊断。

PCR诊断方法：(1)价格比较贵，且需要特殊的设备和技术；(2)检测没有标准化，缺乏临床比较验证。

可见，上述常用的检测方法主要存在耗时长、需要特殊仪器(PCR仪)、成本高的问题，只能靠实验室检测，并不能满足实际的检测需求，更不具备大规模推广应用的条件。

环介导恒温扩增技术(简称LAMP)是2000年开发出来的一种新的核酸扩增技术，它利用Bst大片段DNA聚合酶和根据不同靶序列设计的两对特殊的内引物(FIP和BIP)、外引物(F3和B3)，特异地识别靶序列上的6个独立区域。采用LAMP在恒温(65℃)的条件下反应1小时即可完成核酸扩增反应，然后通过荧光染色直接目测比色就可以得到清晰的反应结果，不需要长时间的温度循环，不需要PCR等昂贵的仪器，也不需要繁琐的电泳紫外观察等过程。因此，LAMP具有简单、快速、特异性强的特点，是能代替PCR方法的最新技术。目前，运用环介导恒温扩增技术检测临床肺炎支原体已有相关文献记载，例如专利公开号：CN101665827A(肺炎支原体快速检测试剂盒及使用方法)、CN107236798A(环介导等温扩增技术检测肺炎支原体的方法)等。