[发明专利]一种慢病毒、重组间充质干细胞及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种慢病毒、重组间充质干细胞及其构建方法和应用，慢病毒载体，是过表达TGF‑β1的慢病毒载体，能够感染人间充质干细胞并建立的稳定表达细胞系，其感染效率高；重组间充质干细胞，重组间充质干细胞通过慢病毒感染间充质干细胞得到，为经过表达TGF‑β1的慢病毒载体所感染，感染后能够建立的稳定表达细胞系；重组间充质干细胞的应用，培养重组间充质干细胞并得到外泌体，本发明中得到的外泌体，具有DNA损伤、促进细胞增殖、损伤修复的作用，抑制细胞衰老，在皮肤疾病与再生修复领域具有广阔的用途。

技术领域

本发明涉及一种慢病毒、重组间充质干细胞及其构建方法和应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

基因治疗是一种新型的重组蛋白转运方法，具有明显的优势，包括稳定，有效和永久的基因表达，对受体相同的糖基化模式以及对受体无免疫原性。病毒载体对分裂期及非分裂期细胞均具有感染作用，能使目的基因进入靶细胞并能够稳定长期得表达，可向同一细胞引入多种基因，或对同一细胞进行对此转染，不易引起靶细胞的免疫反应，生物学安全性也较高。

随着时间的流逝，细胞损伤的积累是引发衰老和癌症发作的关键机制之一。细胞衰老可能是由各种细胞类型中的DNA，脂质或蛋白质改变驱动的。成体组织增殖潜能的丧失是促进衰老的主要机制之一，其中包括免疫细胞增殖(如T细胞)的下降、胰腺细胞增殖的年龄依赖性下降以及肝细胞的年龄相关性凋亡。相反，在生理组织中，诸如TGF-β信号通路的细胞抑制和促凋亡作用对于预防高增殖性疾病的产生至关重要。TGF-β诱导的细胞周期抑制能力主要是通过细胞依赖性激酶抑制剂CDKN2B(编码p15/ink4b)、CDKN1A(编码p21/cip/waf1)和p27/kip1上调或通过下调转录因子c-Myc和DNA抑制剂(ID)结合蛋白ID1、ID2和ID3诱导G1/S期阻滞，因此正常细胞建立了保持增殖“记忆”的调节机制，以防止超过一定数量的传代后细胞继续分裂。这些传代能促进与衰老相关的过程，这种增殖性记忆被认为主要是通过端粒缩短来维持的。除了已分化组织的增殖潜能外，更多的证据表明，维持无限的体细胞干细胞增殖和更新能力是延缓衰老和延长寿命的另一个关键先决条件。现有技术将TGF-β或外泌体，和免疫细胞如T细胞共培养，达到激活或调节免疫细胞的作用。

除了TGF-β超家族成员例如BMP-4和Nodal在维持和正常功能的胚胎干细胞种群中已经确立的作用外，越来越多的证据表明TGF-β类因子对于正常的体细胞干细胞生物学也是至关重要的，包括肠道、毛囊表皮、神经和间充质干细胞(MSC)。MSC具有自我更新和多向分化的潜能，成为再生医学领域常用的种子细胞，其来源广泛，可来自骨髓、脐带、脂肪等。MSC具有许多临床应用，因为它通过与淋巴细胞接触具有免疫抑制和抗炎特性，与先天性和适应性免疫反应相关。

通过基因修饰或许可以加强MSC的免疫调节作用，将成为免疫性皮肤疾病的新选择。目前主流的MSC转基因技术使用脂质体转染的方法，该方法细胞毒性大、转染效率低，并且只能转染正在分裂的细胞，因此严重制约了MSC转基因的研究和生产。而慢病毒技术可以克服上述方法的缺点。它对细胞的毒性小，感染效率高，而且可以高效率感染静止期的细胞。但由于现有技术中MSC的转基因效率低，难度高，实现存在一定的困难，领域中一直未能实现。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的第一个目的在于提供一种慢病毒载体，是过表达TGF-β1的慢病毒载体，能够感染人间充质干细胞并建立的稳定表达细胞系，其感染效率高。

本发明的第二个目的在于提供一种重组间充质干细胞，为经过表达TGF-β1的慢病毒载体所感染，感染后能够建立的稳定表达细胞系。

本发明的第三个目的在于提供一种上述重组间充质干细胞的构建方法，该方法重复稳定性良好，方法简单。

本发明的第四个目的在于提供一种上述重组间充质干细胞的应用，为从重组间充质干细胞建立的稳定表达细胞系中获取外泌体，外泌体具有显著的抗衰老作用。