[发明专利]一种工程化外泌体在糖尿病足溃疡的皮肤再生修复中的应用及其制备方法

权利要求书

1.一种工程化外泌体在糖尿病足溃疡的皮肤再生修复中的应用，其特征在于：所述工程化外泌体是由用于促进血管再生的基因导入到外泌体中所获得。

2.如权利要求1所述的工程化外泌体在糖尿病足溃疡的皮肤再生修复中的应用，其特征在于：

所述外泌体来源于成体干细胞，所述成体干细胞包括骨髓间充质干细胞、造血干细胞、脂肪干细胞。

3.如权利要求1或2所述的工程化外泌体在糖尿病足溃疡的皮肤再生修复中的应用，其特征在于：

所述促进血管再生的基因包括VEGF、FGF、angs、TGF-β、TNF。

4.一种如权利要求1-3任一项所述的应用中的工程化外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、干细胞外泌体的提取：采用超高速离心法提取外泌体；

S2、干细胞外泌体的鉴定：将步骤S1中得到的干细胞外泌体采用透射电镜观察外泌体形貌、蛋白质免疫印迹对外泌体标志蛋白进行鉴定、纳米颗粒跟踪分析评估外泌体的粒径分布；

S3、促进血管再生的基因的导入：将促进血管再生的基因导入到步骤S2通过鉴定后的干细胞外泌体中。

5.如权利要求4所述的工程化外泌体的制备方法，其特征在于：

步骤S1包括：

S1.1：将3-5代干细胞生长至汇合度80％时，弃干细胞完全培养基，换为不含血清的培养基饥饿48h，收集饥饿后的培养基；

S1.2：将步骤S1.1所得的培养基于4℃，2000×g离心10min，弃沉淀，收集上清；

S1.3：将步骤S1.2所得的上清于4℃，10000×g离心1h，弃沉淀，收集上清；

S1.4：将步骤S1.3所得的上清用0.22μm真空过滤器过滤，收集滤液；

S1.5：将步骤S1.4所得的滤液于4℃，100000×g离心1h，弃上清，收集沉淀；

S1.6：将步骤S1.5所得的沉淀用与培养基等体积的PBS将沉淀重悬，于4℃，100000×g离心1h，弃上清，收集沉淀；

S1.7：将步骤S1.6所得的沉淀用100-200μL PBS重悬，得到外泌体。

6.如权利要求4或5所述的工程化外泌体的制备方法，其特征在于：

在步骤S2中，若同时满足以下三个条件：

透射电镜观察外泌体形貌：茶杯托样；

蛋白质免疫印迹对外泌体标志蛋白进行鉴定：标记物抗体呈阳性；

纳米颗粒跟踪分析评估外泌体的粒径分布：40-200nm；

则鉴定出步骤S1的提取物为外泌体。

7.如权利要求4所述的工程化外泌体的制备方法，其特征在于：

步骤S3具体为：采用电穿孔的方法将促进血管再生的基因导入到步骤S2通过鉴定后的干细胞外泌体中。

8.如权利要求6所述的工程化外泌体的制备方法，其特征在于：

步骤S3具体为：采用电穿孔的方法将促进血管再生的基因导入到步骤S2通过鉴定后的干细胞外泌体中。

9.如权利要求7或8所述的工程化外泌体的制备方法，其特征在于：

步骤S3包括：

S3.1：将促进血管再生的基因和干细胞外泌体按1:3wt加入0.4cm厚度的电转杯中，用电穿孔缓冲液稀释至400μL；

S3.2：将步骤S3.1的电转杯放入电转仪中，设置电转的参数，对基因和外泌体进行电转；

S3.3：将步骤S3.2的电转产物转移至1.5mL EP管中，于4℃，25000×g离心1h，去上清，得到纯化后导入了基因的外泌体，即工程化外泌体。