[发明专利]一种适用于质谱鉴定的草莓雌蕊蛋白提取方法

权利要求书

1.一种适用于质谱鉴定的草莓雌蕊蛋白提取方法，包括：步骤1)、以草莓花雌蕊作为样品；步骤2)、蛋白提取；步骤3)、蛋白酶解；其特征是：所述步骤2)依次包括以下步骤：

2.1)、在0.2g样品中加入800±50μl预冷的提取液Ⅰ混匀，再加入800±50μl预冷的提取液Ⅱ进行首次抽提，得到溶液层以及位于底部的细胞沉淀；所述溶液层分为3层，从上至下依次为酚层、中间层和水层；

所述提取液Ⅰ：含0.7M蔗糖、0.1M氯化钾、0.5M Tris、2％巯基乙醇和50mM EDTA的水溶液，调pH至8.0；

所述提取液Ⅱ：苯酚在Tris-HCl缓冲液中充分饱和的溶液；

2.2)、在步骤2.1)首次抽提所得的酚层中加入600±50μl提取液Ⅰ进行二次抽提，得二次抽提酚层；

2.3)、在步骤2.1)首次抽提所得的中间层和水层中加入800±50μl氯仿进行抽提；去除抽提所产生的水层，将抽提所产生的中间层和位于最下层的氯仿层与上述步骤2.2)所得的二次抽提酚层进行合并；

在所得的合并液中，加入6±1ml预冷的0.1M醋酸铵甲醇，于-18～-22℃静置12～16小时，离心后弃上清；所得的沉淀经预冷的甲醇清洗，冻干，得蛋白粉；

所述步骤2.1)、步骤2.2)、步骤2.3)的抽提均为：冰上颠倒混匀30±5min，于3～5℃离心；

2.4)、在步骤2.3)所得的蛋白粉中加入400±50μL裂解液，涡旋后超声，使蛋白粉溶解，所得的溶解液离心，取上清为蛋白溶液；

所述裂解液为：8M尿素，0.1M Tris-HCl，1mM PMSF，调pH至8.0。

2.根据权利要求1所述的一种适用于质谱鉴定的草莓雌蕊蛋白提取方法，其特征是：所述步骤3)为：将步骤2)所得的蛋白溶液还原烷基化，超滤除杂后于30～37℃胰酶酶解，所得肽段溶液除盐后冻干，得冻干肽段。

3.根据权利要求2所述的一种适用于质谱鉴定的草莓雌蕊蛋白提取方法，其特征是：所述步骤3)为：

取含200μg蛋白的蛋白溶液加入50mM NH₄HCO₃定容至100μL，再加入11μL、100mM的DTT溶液，混匀后于37±1℃反应1±0.2h；加入12μL 500mM的IAM溶液，避光室温反应25～35min；

将所得反应液利用Amicon-Ultra-15超滤管除杂后加入50mM NH₄HCO₃至体积为200μl，加入4μg Trypsin，于37℃酶解12h～16h；酶解完成后，离心；再向超滤管中加入50mMNH₄HCO₃后，离心；得肽段溶液。

4.根据权利要求3所述的一种适用于质谱鉴定的草莓雌蕊蛋白提取方法，其特征是：

所述步骤2.4)的超声为：于冰水浴中，以1000000焦耳能量、超声3s间歇5s的模式超声2min。

5.根据权利要求1～4任一所述的一种适用于质谱鉴定的草莓雌蕊蛋白提取方法，其特征是：所述步骤1)为：取开花一天期的草莓花，将雌蕊液氮研磨成粉，作用样品。

6.根据权利要求5所述的一种适用于质谱鉴定的草莓雌蕊蛋白提取方法，其特征是：所述草莓为红颊草莓。

7.利用如权利要求1～6任一方法所得的冻干肽段进行的质谱鉴定方法，其特征是：

冻干肽段用0.1％甲酸水复溶后，经Acclaim^TM PepMap^TM 100 C18液相色谱柱2h梯度在线分离后，进入Q Exactive质谱仪进行DIA模式扫描分析；得到的原始文件导入分析软件Spectronaut Pulsar，与已有的草莓柱头蛋白鉴定库匹配后得到蛋白鉴定结果。