[发明专利]核酸提取用固相基底的制备方法及其应用

说明书

本发明公开了一种核酸吸附基质修饰固相基质的制备方法及其在核酸分离中的应用，主要步骤包括以下内容：1)修饰固相基质连续内表面，以便于提供结合核酸吸附基质的所需的离子、共价或其他化学键；2)将核酸吸附基质溶解在MES缓冲液或醋酸溶液中，然后注入固相基质连续内表面形成涂层；3)裂解液裂解含有病原体的样本后，使用结合液调制裂解液以提供核酸吸附基质吸附核酸所需的环境，然后将溶液注入固相基质中；4)使用pH介于3‑10之间的任意清洗缓冲液清洗固相基质，清除杂质；5)将pH8的低盐洗脱缓冲液注入固相基质连续内表面中，以便于洗脱核酸或直接进行扩增检测。

技术领域

本发明涉及核酸提取技术领域，具体而言，涉及一种核酸提取用固相基底的制备方法及其应用。

背景技术

核酸提取对于后续的聚合酶链反应(PCR)或等温扩增等过程至关重要。新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染的肺炎疫情暴发以来，普通实时荧光定量PCR核酸检测试剂的迅速上市和临床应用在患者临床诊断和疑似患者排查中发挥了重要作用，但是受核酸提取操作繁琐、耗时长、需要集中送检等限制，还不能满足当前快速增长的大量疑似患者、无症状感染者等排查诊断的检测需求。这就对于研发适用于现场应用的新型核酸提取方法、提取试剂盒和提取系统提出了需求。

传统的核酸提取纯化方法包括液-液提取纯化法、固相提取纯化(SPE)法。酚-氯仿提取是一种液-液核酸提取法，需使用酚、氯仿等高毒性的试剂，操作步骤复杂，耗时长，涉及多步离心，剪切力可能降解核酸，不适于自动化和微型化。

基于硅基质的固相萃取方法虽然操作简单，能够省去一些有毒有机溶剂的使用，但由于固液分离仍然依靠多步离心导致耗时长，而且也容易对核酸造成损伤；另外丙醇等离液试剂的加入，一方面会抑制下游PCR聚合酶的活性，另一方面清洗步骤变得严格、繁琐和冗长，进而降低核酸回收率。

基于磁性材料的磁性固相萃取技术避免了离心分离步骤产生的剪切力而使核酸降解的可能性，但作为固相吸附剂的磁性微粒需要通过外加磁场实现分离，这明显增加了核酸提取操作过程的复杂性。

考虑到所有技术开发都应以应用为目的，一种理想的方法在提供高质量、高纯度核酸的同时，还应尽量在短时间内完成，这对于RNA提取十分重要。这主要是由于RNA酶在细胞裂解物本身和环境中普遍存在，RNA更容易在细胞裂解过程中降解。此外，这样的方法还应该尽可能地简化操作过程，并且应该非常适合与后续扩增过程集成。

发明内容

为了克服现有技术的缺陷，本发明的首要目的在于提供核酸提取用固相基底的制备方法，即核酸吸附基质与固相基底连续内表面，通过离子、共价或其他化学键化学键合等方法结合，进而完成核酸提取用固相基底的制备，该制备方法简单，条件温和，重现性好。

第一方面，本发明提供了一种核酸提取用固相基底的制备方法，包括以下步骤：

1)对固相基底进行前处理；

2)对步骤1)前处理后的固相基底连续内表面修饰核酸吸附基质；

3)对步骤2)处理后的固相基底进行清洗，去除未结合的核酸吸附基质；

4)对步骤3)处理后的固相基底进行干燥烘干。

在具体实施方式中，步骤1)所述固相基底选自离心管或微型离心管、微流控芯片、孔板或深孔板、槽或深槽中的一种或几种；所述前处理为采用化学修饰方法在固相基底上修饰羧基、羟基和碳氧双键，优选地，所述化学修饰方法为采用铬酸和硫酸组合配置的氧化溶液，通入固相基底，在室温下反应过夜。