[发明专利]西尼罗病毒免疫吸附剂的制备方法、免疫吸附剂及其应用

说明书

本发明提供了一种西尼罗病毒免疫吸附剂的制备方法、免疫吸附剂及其应用。该制备方法以含醛基的活化载体为吸附载体，以西尼罗病毒抗体为配体，在海藻糖和醋酸‑醋酸盐缓冲液组成的保护液中，能够在20～70℃的条件下进行偶联反应，得到高吸附率的西尼罗病毒免疫吸附剂。本发明在海藻糖和醋酸‑醋酸盐缓冲液的协同保护下，能够在高温和酸性条件下保持抗体的活性，并能促进抗体在吸附载体表面的沉降和吸附，进而提高偶联反应效率及偶联程度，从而无需封端和还原，就能得到吸附率高、吸附性能稳定的免疫吸附剂。此外，抗体在偶联反应后仍有较高活性，可再利用，从而降低成本。本发明制备的免疫吸附剂可用于免疫吸附柱的制备，且储存稳定性好。

技术领域

本发明属于生物医学材料及病毒吸附技术领域，涉及一种西尼罗病毒免疫吸附剂的制备方法、免疫吸附剂及其应用。

背景技术

西尼罗病毒(WNV)是一种全球传播的人畜共患的虫媒病毒，于1937年从乌干达西尼罗地区一名发热妇女血液中分离出来而被发现。此后数年间，该病毒主要在非洲、中东、欧洲和澳大利亚等地流行，该病毒于1999年传入美国后，迅速引起了美国虫媒病毒相关脑炎的流行。WNV主要经蚊传播，可导致人类罹患神经系统疾病甚至死亡，也可引起马、禽类、猫等动物发病，目前尚无针对西尼罗的特效治疗药物。

免疫吸附疗法是近20年来发展起来的一种新技术，它是将高度特异性的抗原、抗体或某些具有特定物理化学亲和力的物质(配体)与吸附材料(载体)结合，制成吸附剂或吸附柱，利用其特异性吸附性能，选择性或相对特异性地清除患者血液中内源性致病因子，达到缓解病情的目的。合成的吸附剂要求具有高吸附效率和低的非特异性吸附，因此配基和载体的选择都很重要。

琼脂糖凝胶、纤维素凝胶、聚乙烯醇凝胶等表面含有大量的羟基，对羟基进行活化可以有效地固定所需的配基。其中，通过高碘酸盐进行氧化活化是目前较为常用的方法，凝胶上羟基被氧化为醛基，醛基在pH为4～6的条件下可与抗体蛋白上的氨基发生共价键的偶联反应得到席夫碱，而且适当提高偶联反应温度，有助于促进抗体在吸附载体表面的沉积速度，从而加快反应速率，并能提升免疫吸附剂的吸附性能。这种方法快速、简单、安全，并且抗体蛋白与吸附载体间强有力的共价键保证在使用时蛋白不会脱落在溶液中。

但是由于抗体蛋白在高温或酸性条件下，容易发生失活，从而影响免疫吸附剂的特异性吸附能力和吸附效率，要同时保证蛋白的稳定固定和活性是比较难的。因此现有技术大多在40℃以下的缓冲溶液中进行偶联反应，温度的限制需要通过偶联反应时间的延长进行弥补，长时间的反应也易造成抗体蛋白的失活及利用率的降低，从而严重限制了免疫吸附效率的进一步提升。同时以抗体作为配基制备吸附剂时，由于抗体制备工艺的限制，导致抗体成本较高，致使吸附剂的成本也大幅增加。例如发明专利CN102000550B公开了一种高碘酸盐氧化制备用于清除治病抗体吸附剂的合成方法，该方法采用琼脂糖凝胶为载体，氧化后与免疫球蛋白进行偶联，最后再进行封端、还原。该方法优选在4～30℃下进行反应，且还需进行封端和还原，消除未偶联的醛基，吸附效率及制备成本都受到限制，不利于大规模制备。

目前，针对西尼罗病毒的抗体还处于试验研究阶段，包膜蛋白E是WNV表面最重要的一类蛋白质，决定了病毒感染细胞种类的特异性，主要与病毒对宿主细胞的侵染过程有关。因此现有的抗体主要为靶向WNV蛋白E的中和性抗体，但尚未广泛应用。由于不同疾病抗体的结构、性质等存在较大差异，而且由于上述制备问题的存在，目前还没有针对西尼罗病毒免疫吸附剂的合适的制备方法。因此，亟需提供一种适用于西尼罗病毒的免疫吸附剂的制备方法。

发明内容

针对上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种西尼罗病毒免疫吸附剂的制备方法、免疫吸附剂及其应用，以含醛基的活化载体为吸附载体，以西尼罗病毒抗体为配体，在海藻糖和醋酸-醋酸盐缓冲液组成的保护液中进行高温偶联反应，能够得到吸附率高、吸附性能稳定的免疫吸附剂，且偶联反应后的抗体能重复利用。将其用于免疫吸附柱的制备，具有良好的吸附性和储存稳定性。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：