[发明专利]一种草酸青霉16的β-葡萄糖苷酶突变体TLE及应用

说明书

本发明涉及一种草酸青霉16的β‑葡萄糖苷酶突变体TLE及应用，所述的β‑葡萄糖苷酶突变体TLE的氨基酸序列为SEQ ID NO：3。β‑葡萄糖苷酶突变体TLE最适反应温度为65℃，催化效率常数k_cat/K_m达到了983.68 mM^‑1S^‑1，葡萄糖抑制强度K_appm/K_I值为0.35（当20mmol/L葡萄糖时），分别是原始酶的1.22倍和0.3倍，其葡萄糖耐受性能提高263%，表现出更高产物耐受性和更高活性，β‑葡萄糖苷酶突变体TLE可应用于饲料、医药、食品、化工、能源等领域。

技术领域

本发明涉及一种草酸青霉16的β-葡萄糖苷酶突变体TLE及应用，具体属于酶工程技术领域。

背景技术

β-葡萄糖苷酶能将底物水解为β-D-葡萄糖和相应配基，但是由于原始β-葡萄糖苷酶具有较差的酶学特性，比如催化活性较低、葡萄糖耐受性较差以及催化温度较高，这很难应用于饲料、医药、食品、化工、能源等众多领域。

草酸青霉16的β-葡萄糖苷酶对呋喃衍生物和酚类化合物具有不受抑制的活性，并且对高浓度的KCl、NaCl和乙醇具有极好的耐受性，然而，野生型16BGL的最适温度约为70℃，其活性和葡萄糖耐受性较低。本发明通过分子改造技术获得了一种突变体TLE，突变体TLE具有较高催化效率和高葡萄糖耐受性，可满足饲料、医药、食品、化工、能源等众多领域的要求，具有很好的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种草酸青霉16的β-葡萄糖苷酶突变体TLE及其应用。本发明通过高通量筛选，最终获得了在较低温度下，具有较高葡萄糖耐受性和较高活性的突变体TLE，并重组构建了组成型表达的毕赤酵母GS115工程菌，为实现其应用打下了基础。

本发明一种草酸青霉16的β-葡萄糖苷酶突变体TLE的氨基酸序列为SEQ ID NO：3，其编码基因的核酸序列为SEQ ID NO：4；草酸青霉16的β-葡萄糖苷酶为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的第280位蛋氨酸突变为苏氨酸、第484位的缬氨酸突变为亮氨酸，以及第589位的天冬氨酸突变为谷氨酸。

所述的编码基因通过插入到载体pGAPZaA，插入位点为Not I和EcoRI，获得重组载体pGAPZaA-TLE。

所述的重组载体pGAPZaA-TLE用Bgl II限制性内切酶线性化后，再电转到毕赤酵母GS115，获得重组毕赤酵母GS115工程菌。

所述的重组毕赤酵母GS115工程菌用于生产β-葡萄糖苷酶突变体TLE。

所述的β-葡萄糖苷酶突变体TLE应用的条件是反应温度为30-70℃，pH3-6。

有益效果：本发明通过分子改造技术获得了一种突变体TLE，β-葡萄糖苷酶突变体TLE最适反应温度为65℃，催化效率常数k_cat/K_m达到了983.68mM^-1S^-1，葡萄糖抑制强度K_appm/K_I值为0.35(当20mmol/L葡萄糖时)，分别是原始酶的1.22倍和0.3倍，其葡萄糖耐受性能提高263％，表现出更高的催化效率和高葡萄糖耐受性，可应用于饲料、医药、食品、化工、能源等领域，具有很好的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例4原始酶和突变体TLE在不同温度下的相对活性；

图2为本发明实施例5原始酶、对照和突变体TLE的纤维素乙醇产量；

图中：对照为没有加入任何β-葡萄糖苷酶。

具体实施方式