[发明专利]一种人促甲状腺激素受体融合蛋白及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种人促甲状腺激素受体融合蛋白及其制备方法和应用。该融合蛋白由HER2蛋白与TSHR蛋白构成，HER2蛋白与TSHR蛋白由连接肽连接。本发明HER2与低表达的TSHR融合表达，在不影响TSHR的结构与功能下，可以提高TSHR的产量和稳定性，并使得TSHR蛋白可以分泌到上清中，有利于纯化。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种人促甲状腺激素受体融合蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

人源促甲状腺激素受体(TSHR)主要存在甲状腺滤泡细胞膜上，部分分布于肝细胞、淋巴细胞、脂肪细胞、眼后成纤维细胞、神经元细胞和星形胶质细胞。hTSHR是一种七次跨膜蛋白，隶属于G蛋白偶联受体家族中的亚家族即糖蛋白受体，该蛋白具有较大的胞外区，跨膜区和胞内区。胞外区负责结合蛋白配体，包括糖蛋白激素和松弛素，其跨膜区负责受体活化和传递G蛋白的信号转导，激活腺苷酸环化酶产生cAMP，启动细胞cAMP第二信号系统的信号级联反应。

在正常生理状态下，促甲状腺激素(TSH)与TSHR特异性结合，启动细胞cAMP第二信号系统，可以促进甲状腺激素分泌，提高甲状腺的摄碘能力，促进甲状腺激素的合成、释放，进而调节甲状腺滤泡细胞生长、分化和功能。在病理状态下，自身反应性T、B细胞被激活，体内产生抗TSHR的抗体，而TSHR与刺激性抗体(TSAb)结合，可以刺激甲状腺细胞增生和功能亢进，过多的合成和分泌甲状腺激素从而引起甲亢；当TSHR与刺激阻断型抗体(TSBAb)结合，阻断TSH的刺激功能，抑制甲状腺功能，从而引起甲状腺功能减低。例如如果TSH受体的抗体以TSAb为主，临床上表现为格雷夫斯病(Graves’disease)病；如果以TSBAb为主，临床上则表现为原发性甲状腺功能减退症。因此临床上以检测血浆中TSHR刺激性抗体(TSAb)来诊断格雷夫斯病。将抗HER2抗体包被在包被板上，TSHR的融合蛋白被特异性的吸附在包被抗HER2抗体的发光板上，捕获血清中抗TSHR的抗体，用HRP标记的相对应的TSHR抗体竞争法定量血清中刺激性抗体(TSAb)的含量。

TSHR基因位于人的14号染色体长臂上，基因全长大约60kb，内有10个外显子和9个内含子，开放阅读框含有2295个核苷酸编码，含有764位氨基酸。TSHR蛋白分为膜外区、跨膜区和膜内区，其中膜外区有418个氨基酸，一个N端和5个糖基化位点；跨膜区有264个氨基酸，呈疏水性，包含7个跨膜区，膜外和膜内各3个环区；膜内区有82个氨基酸，有一个C端和C激酶磷酸化位点。TSHR的膜外区有两个分别为第38～45位和第317～366位氨基酸残基的独特插入片段。第1插入区(第38～45位)与TSH和TRAb与hTSHR的结合有关。第2插入区，包含50个氨基酸残基，位于第317～366位，可能是TSHR羧基端与氨基端相连接的部位，可称之为连接肽，在连接肽的上下游各有一个裂解位点，在翻译后加工过程中，TSHR的膜外区可在这两个位点裂解以切除第二个插入区，从而TSHR形成两个亚基：氨基端部分的A亚基和羧基端部分的B亚基，亚基和亚基通过二硫键连接，然后二硫键在蛋白质二硫键异构酶的作用下被还原破坏。B亚基保留在细胞膜上并释放A亚基，称为A亚基脱落。去除残基第317～366位并不影响TSHR的功能，包括与TSH的结合和细胞内TSH介导的cAMP的聚集。由于单独的TSHR蛋白表达量太低，需要研发一种提高TSHR蛋白表达量的方法。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种人促甲状腺激素受体融合蛋白及其制备方法和应用。该融合蛋白解决了表达量低与稳定性的问题，使表达量高达100mg/L。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种人促甲状腺激素受体融合蛋白，该融合蛋白由HER2蛋白与TSHR蛋白构成，HER2蛋白与TSHR蛋白由连接肽连接。