[发明专利]一种用于检测阪琦肠杆菌的试剂盒、引物对、探针及方法

权利要求书

1.一种用于检测阪琦肠杆菌(Enterobacter sakazakii)的试剂盒，其包括RPA反应体系，其特征在于，所述的RPA反应体系包括RPA引物探针混合液，所述RPA引物探针混合液包括一引物对和探针，所述引物对中上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述探针包含如SEQ ID NO.3所示以及如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述下游引物的5’端采用生物素进行标记；

和/或，所述探针的5’端采用异硫氰酸荧光素标记，所述探针的3’端标记Spacer C3；较佳地，标记后的探针如式：5’-FAM-SEQ ID NO.3-THF-SEQ ID NO.4-Spacer C3-3’所示。

3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述的RPA反应体系包括：2.1μL浓度为10μM的所述上游引物、2.1μL浓度为10μM的所述下游引物、0.6μL浓度为10μM的所述探针、29.5μL水化缓冲液、12.2μL双蒸水以及2.5μL浓度为280μM的醋酸镁；

较佳地，所述的试剂盒还包括阴性对照和/或阳性对照；

所述的阴性对照优选双蒸水；

所述的阳性对照优选阪琦肠杆菌DNA。

4.如权利要求1～3任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述的RPA为RPA-LF。

5.一种用于检测阪琦肠杆菌的引物对，其特征在于，所述引物对中上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

较佳地，所述的上游引物的5’端采用生物素进行标记。

6.如权利要求5所述的引物对，其特征在于，所述的检测为RPA检测，优选RPA-LF检测。

7.一种用于检测阪琦肠杆菌的探针，其特征在于，所述的探针含如SEQ ID NO.3所示以及如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列；较佳地，所述探针的5’端采用异硫氰酸荧光素标记，所述探针的3’端标记Spacer C3；更佳地，标记后的探针如式：5’-FAM-SEQ ID NO.3-THF-SEQ ID NO.4-Spacer C3-3’所示；

其中，所述的检测优选RPA检测，更优选RPA-LF检测。

8.一种用于检测阪琦肠杆菌的寡核苷酸组合，所述的寡核苷酸组合包括如权利要求5或6所述的引物对，以及如权利要求7所述的探针；

较佳地，所述的检测为RPA检测，优选RPA-LF检测。

9.如权利要求6所述的引物对、如权利要求7所述的探针，或者权利要求8所述的寡核苷酸组合在制备检测阪琦肠杆菌的试剂或试剂盒中的应用。

10.一种非诊断目的的检测阪琦肠杆菌的方法，其特征在于，其包括如下步骤：

(1)使用DNA提取试剂提取待检样品中的总DNA；

(2)以步骤(1)提取的总DNA为模板，利用权利要求1～4任一项所述试剂盒中的RPA反应体系进行RPA反应，所述RPA反应中扩增反应的时间优选15min、温度优选39℃；所述的RPA优选RPA-LF；

(3)分析检测结果；其中：

步骤(2)中所得扩增产物较佳地为一端标记荧光素，一端标记生物素的双标记产物；

和/或，步骤(3)中的分析方法较佳地为用GenLine HybriDetect MGHD1胶体金侧流层析试纸条对所述双标记产物进行检测，所述双标记产物优选为稀释后的双标记产物。