[发明专利]一种污泥减量技术中颤蚓的相对定量方法及其应用

权利要求书

1.一种污泥减量技术中颤蚓的相对定量方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）采用荧光定量PCR测定一系列不同拷贝数浓度的颤蚓标准样品的CT值，以颤蚓标准样品的拷贝数浓度的以10为底的对数值为横坐标，CT值为纵坐标，建立颤蚓的相对定量标准曲线；

（2）取不同来源的含有颤蚓的底物基质，各自混匀，烘干，冷却后作为待测物；

（3）分别取相同质量的待测物进行DNA提取，溶解于相同体积的超纯水中，得到基因组DNA混合物溶液；

（4）以与步骤（1）相同的反应体系和反应条件，进行荧光定量PCR，测定所述的基因组DNA混合物溶液的CT值，直接代入所述的相对定量标准曲线，得到待测物的拷贝数浓度；

（5）根据不同来源的待测物的拷贝数浓度相对大小，即可直接判断不同来源的待测物中颤蚓生物量的相对多寡；

步骤（1）中所述的荧光定量PCR所用的引物的序列如下：

正向引物：5’-AGCTCGTAGTTGGATCTC-3’；

反向引物：5’-CTGCTTTGAGCACTCTAA-3’；

所述的荧光定量PCR所用的探针的序列为：

5’-AAAGCACTCAGCGAAGAGCAC-3’；

所述的荧光定量PCR的反应体系为20μL：Premix EX Taq 10μL、正向引物 0.4μL、反向引物 0.4μL、探针 0.8μL、DNA 2μL、ddH₂O余量；

所述的荧光定量PCR的反应条件为：95℃ 60s；95℃ 5s、60℃ 20s，循环45次；

所述的颤蚓标准样品满足如下要求：颤蚓标准样品的拷贝数浓度的数量级范围为10¹～10¹¹，以10倍进行等分；

所述的颤蚓标准曲线满足如下要求：标准曲线的R²值＞0.99；标准曲线的扩增效率在95%～105%之间；

步骤（2）中所述的烘干的条件为置于50℃～70℃鼓风干燥箱中烘干2～3h。

2.根据权利要求1中所述的污泥减量技术中颤蚓的相对定量方法，其特征在于：

步骤（1）中所述的颤蚓标准样品通过包括如下步骤的方法制得：

a. 提取颤蚓基因组DNA；

b. 以提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到目的片段；

c. 将所得目的片段与载体进行连接，转化，对阳性克隆进行测序后，对测序正确的阳性克隆进行扩大培养；

d. 提取及纯化回收质粒，得到所述的目的片段的浓集溶液；测定所述的浓集溶液的DNA浓度，并换算成拷贝数浓度；

e. 对所得浓集溶液进行梯度稀释，即得到一系列不同拷贝数浓度的颤蚓标准样品。

3.根据权利要求2中所述的污泥减量技术中颤蚓的相对定量方法，其特征在于：

步骤b.中所述的PCR的反应体系为20μL：Premix Taq 10μL、正向引物 0.6μL、反向引物0.6μL、DNA 2μL、ddH₂O余量；

步骤b.中所述的PCR的反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s、55℃退火30s、72℃复性30s，循环35次；72℃延伸；

步骤d.中所述的换算所用的公式为：拷贝数浓度=DNA浓度*7.665*10⁹，拷贝数浓度的单位为copies/μL，DNA浓度的单位为ng/μL。

4.根据权利要求1中所述的污泥减量技术中颤蚓的相对定量方法，其特征在于：

所述的底物基质为污泥减量装置中的生物载体填料、污水处理装置中的活性污泥或自然环境底泥。

5.权利要求1～4任一项中所述的污泥减量技术中颤蚓的相对定量方法在污水处理领域中的应用。