[发明专利]白喉毒素调控清除免疫细胞的CD45-DTR转基因小鼠的构建方法与应用

权利要求书

1.一种白喉毒素调控清除免疫细胞的CD45-DTR转基因小鼠的构建方法，包括以下步骤：

S1. 酶切线性化BAC Clone CD45-DTR，利用电穿孔法导入小鼠胚胎干细胞BALB/C ES细胞，得到插入IRES-DTR至CD45外显子1位点的BALB/C ES细胞；

S2. 利用插入IRES-DTR至CD45外显子1位点的BALB/C ES细胞，囊胚注射法构建插入IRES-DTR至CD45外显子1位点的CD45-DTR转基因小鼠。

2.根据权利要求1所述的一种白喉毒素调控清除免疫细胞的CD45-DTR转基因小鼠的构建方法，其特征在于，所述步骤S1具体包括以下步骤：

(1) 小鼠胚胎成纤维细胞用MEF培养基培养，经30Grayγ射线灭活处理后作为滋养层细胞，BALB/C ES细胞(以下简述为ES细胞)种在滋养层细胞上，用ES培养基培养；

(2) 电穿孔法将利用PI-SceI酶切线性化的打靶载体BAC Clone CD45-DTR转入ES细胞，使BAC Clone CD45-DTR整合至基因组中；

(3) 利用G418阳选，挑选得到插入BAC Clone CD45-DTR的BALB/C ES细胞克隆；

(4) 提取ES细胞基因组DNA为模板，进行PCR鉴定。

3.根据权利要求2所述的一种白喉毒素调控清除免疫细胞的CD45-DTR转基因小鼠的构建方法，其特征在于，所述步骤4具体为：

提取ES细胞基因组DNA为模板，利用序列为SEQ ID NO.17的正向引物和序列为SEQ IDNO.18的反向引物进行PCR鉴定，插入BAC Clone CD45-DTR的ES细胞阳性克隆可见约4.1kb条带。

4.根据权利要求1所述的一种白喉毒素调控清除免疫细胞的CD45-DTR转基因小鼠的构建方法，其特征在于，所述步骤S2具体包括以下步骤：

(1) 插入BAC Clone CD45-DTRBALB/C ES细胞注射入C57BL/6J囊胚，再接种到假孕的KM母鼠子宫中，出生得到毛色为黑色和白色混杂嵌合体小鼠；

(2) 提取转基因小鼠鼠尾DNA作为模板，PCR鉴定；

(3) 利用白色占比最高的5只雄性转基因嵌合体小鼠F0与BALB/c雌鼠交配，得到毛色为白色的小鼠可能为DC SIGN-DTR转基因杂合小鼠，小白鼠经鼠尾PCR鉴定后得到DC SIGN-DTR转基因杂合小鼠，即为F1代小鼠，鼠尾PCR鉴定方法同步骤2；

(4) F1代小鼠与C57BL/6J母鼠杂交进行传代、培育，同时对所得的子代小鼠进行鼠尾PCR 鉴定，鉴定方法同步骤2，得到F2代小鼠，按相同方法对小鼠进行传代。

5.根据权利要求4所述的一种白喉毒素调控清除免疫细胞的CD45-DTR转基因小鼠的构建方法，其特征在于，所述步骤2具体为：

提取转基因小鼠鼠尾DNA作为模板，利用序列为SEQ ID NO.19的正向引物和序列为SEQID NO.20的反向引物作PCR鉴定，带有IRES-DTR的阳性小鼠可见约1.2kb条带。

6.如权利要求1-5任一项所述的白喉毒素调控清除免疫细胞的CD45-DTR转基因小鼠的构建方法在研究免疫细胞功能方面的应用。

7.如权利要求1-5任一项所述的白喉毒素调控清除免疫细胞的CD45-DTR转基因小鼠的构建方法在制备人源化小鼠方面的应用。

8.如权利要求1-5任一项所述的白喉毒素调控清除免疫细胞的CD45-DTR转基因小鼠的构建方法建立清除免疫细胞小鼠模型的方法，包括以下步骤:在第1、第2、第4、第7天分别腹腔注射DT(20ng/g)，特异性清除小鼠免疫细胞,建立清除免疫细胞小鼠模型。