[发明专利]一种具有双表达盒的GS表达载体及其应用

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高表达细胞株开发中谷氨酰胺合成酶表达载体的构建及应用。本发明所提供的谷氨酰胺合成酶表达载体具有第一表达盒元件，第二表达盒元件，谷氨酰胺合成酶表达元件，氨苄青霉素β内酰胺酶水解酶表达元件，复制起始位点ORI，该载体被命名为PGS‑2，利用该构建的谷氨酰胺合成酶表达载体可同时表达两个蛋白，或者表达一个蛋白的两个亚基，最后进行组装，与现有方法相比具有更好的操作便利性，且蛋白表达量提高了8倍以上。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高表达细胞株开发中谷氨酰胺合成酶表达载体的构建及应用。

背景技术

纵观2018年，全球畅销药物排行榜，最畅销的10大药物中，生物技术蛋白类药物，占了9席，抗体药王修美乐(Humira)自2012年来一直居首位，2018年销售199.36亿美金。蛋白类药物已经成为药物市场的主力军，在肿瘤类疾病，血管类疾病，风湿类疾病，高血压等疾病中，均有亮眼的表现。

生物技术的发展也是日新月异，蛋白类药物从细胞因子、Fc融合蛋白、单克隆抗体、纳米抗体到双特异性抗体，逐步进化，并且随着现代培养基技术、细胞株和载体的改造技术的进步，细胞的表达量在逐渐的上升，抗体表达量也从mg/L到g/L。

在哺乳动物细胞大规模生产中，常用的可扩增选择标志基因最常用的基因筛选扩增系统有二氢叶酸还原酶系统(DHFR)和谷氨酰胺合成酶系统(GS)。二氢叶酸还原酶能够被叶酸类似物氨甲喋呤(MTX)所抑制，含有的目的基因及与之相连的DHFR筛选标记基因在MTX的浓度不断提高的条件下，两个基因偶联，进行扩增数千倍，从而提高目的基因的表达量。谷氨酰胺合成酶系统(GS)是最近新发展的基因筛选扩增系统，较DHFR系统有明显的优越性，目前在国际上得到了广泛地认可，系统中加入谷氨酰胺合成酶的抑制剂蛋氨酸磺酰胺(MSX)，可使GS基因及与之相连的目的基因扩增，达到提高目的基因表达水平的目的。GS系统相比于DHFR系统有更好的应用便利性，GS系统只需要一轮加压，就可完成表达细胞株的筛选，不需要多轮加压，提高蛋白的表达量，而DHFR系统需要多轮的逐渐加压，时间周期长，操作繁琐。并且GS系统在大规模发酵培养时无需添加谷氨酰胺，利用细胞内的氨和谷氨酸合成谷氨酰胺，避免谷氨酰胺分解造成体系中氨浓度过高，造成对细胞的损伤，降低了成本，降低了工艺控制难度，细胞在大规模开发中有更好的表现。

目前，市场上表现较好的细胞株有Lonza公司的CHOK1SV GS-KO细胞株、Merk公司(原SAFC)的CHOZN CHO K1细胞株和Horizon Discovery公司的CHO GS null细胞株。Lonza和Merk公司是用ZFN技术进行GS基因敲除，Horizon Discovery公司是用rAAV病毒技术进行GS基因敲除。国内有多家公司分别引进了不同的细胞表达系统，进行蛋白的表达，但是这些系统的使用费一般在几百万到上千万，甚至还有上市后药物的销售分成，严重限制这些系统的使用。现急需开发一款适合我们自己的表达量较高的细胞表达系统。Lonza公司的PXC17.4载体和PXC18.4载体，为两个载体的组合，表达一个蛋白时用PXC17.4载体，表达两个蛋白时，两个蛋白分别克隆入PXC17.4载体和PXC18.4载体，并且通过酶切，连接，构建一个含有两个表达盒的表达体系，操作繁琐。专利CN104195173公布了一个具有双表达盒的谷氨酰胺表达载体，也含有两个表达盒，但是其在实施例中的表达量仅有600mg/L，表达量偏低，严重限制其应用。我们针对目前对表达体系的需求，开发了一款表达量较高的GS双表达盒表达载体，表达量较高，已经在多种蛋白上成功使用。

发明内容

本发明公布了一种具有双表达盒的谷氨酰胺合成酶表达载体，以及该载体在制备抗体中的应用，从而解决现有技术中的产物的产率低、操作繁琐、价格高等问题。

本发明的第一个目的在于提供一种谷氨酰胺合成酶表达载体，其具有两个蛋白表达盒，可同时表达两个蛋白，或者表达一个蛋白的两个亚基，最后进行组装，该载体被命名为PGS-2。