[发明专利]用于快速鉴定产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌的引物及检测方法

说明书

本发明属于检验检疫领域，特别涉及用于快速鉴定产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌的引物及其检测方法。本发明包括上游外引物F3、下游外引物B3、上游内引物FIP和下游内引物BIP。本发明的LAMP引物是针对产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌基因cesB设计出4条特异性引物，特异性高。本发明的LAMP检测方法对产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌的检测灵敏度可达到0.0124ng/25μL。应用本发明方法，可对含产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌样本进行快速检测，且LAMP核酸扩增是在等温条件下进行，不需要复杂的仪器设备和昂贵的分子试剂，结果肉眼直接可见。

技术领域

本发明属于检验检疫领域，特别涉及用于快速鉴定产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌的引物及其检测方法。

背景技术

蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)是一种可引起食物中毒的常见食源性致病菌。食用了被蜡样芽胞杆菌污染的食品易引发腹泻和呕吐，导致食物中毒，甚至会引发心内膜炎、脑膜炎和菌血症等疾病。蜡样芽胞杆菌可导致腹泻型和呕吐型两种不同类型的食物中毒，分别由其产生的腹泻毒素(肠毒素)和呕吐毒素引起。据报道，当被污染的食品中蜡样芽孢杆菌数量超过10⁵CFU/g可能导致食物中毒甚至死亡。

国外蜡样芽胞杆菌引起的食物中毒事件频发。1950年在挪威发表了第一起蜡样芽胞杆菌食物中毒的报告，之后许多国家，尤其是欧洲一些国家相继报告了类似食物中毒的爆发。蜡样芽胞杆菌已被挪威和荷兰认定为食品中最容易检出的病原微生物。我国在上世纪70年代确认蜡样芽胞杆菌中毒事件后，此类中毒事件的报道逐年增多。据2008-2015年我国国家食源性疾病监测网统计资料显示，微生物性食源性疾病占比39％，居首位，其中蜡样芽胞杆菌引起的中毒事件占17％，在细菌性病原体中排在第三，危害极为严重。在我国由蜡样芽胞杆菌引发的食品中毒主要是由呕吐毒素引起的(约占75％)。因此，蜡样芽胞杆菌尤其是呕吐型菌株的快速检测尤为重要。

我国目前检测蜡样芽胞杆菌的方法是食品安全国家标准食品微生物学检验蜡样芽胞杆菌检验(GB 4789.14—2014)。主要分为以下几步：增菌、分离培养、镜检、生化鉴定、生化分型。而对于分离的蜡样芽胞杆菌主要是采用PCR的方法鉴定其是否是呕吐毒株(呕吐毒素基因存在与否)。环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)作为一种新兴的检测方法，一经报道就受到各国学者的广泛关注。LAMP方法与PCR技术相比，检测时间短，具有更高的灵敏度和特异性，操作简单，仅仅需要普通水浴锅就可以完成检测。在食源性致病菌方面，目前已经建立了副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、沙门氏菌(Salmonella spp.)和蜡样芽胞杆菌等致病菌的LAMP技术，但没有产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌LAMP的报道。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供用于快速鉴定产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌的引物。

本发明以产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌基因cesB为靶基因，设计LAMP反应特异性引物，构建LAMP反应体系，建立一种更为特异、灵敏的快速鉴定技术，为卫生检验和食品质量安全提供技术保障，提高我国公共卫生控制水平。

本发明另一目的在于提供一种采用上述引物以LAMP法快速鉴定产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌的检测方法。

本发明再一目的在于提供上述检测方法的应用。

本发明的目的通过下述方案实现：

用于快速鉴定产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌的引物，包括上游外引物F3、下游外引物B3、上游内引物FIP和下游内引物BIP，序列如下所示：

F3：5’-CTACAACAATTTTCTGCAAAGT-3’

B3：5’-AGCCAAGTGAAGAATACCAT-3’