[发明专利]一种基于金属离子依赖性DNA酶用于检测邻苯二甲酸二丁酯的电化学免疫传感器制备方法

权利要求书

1.一种基于金属离子依赖性DNA酶用于检测邻苯二甲酸二丁酯的电化学免疫传感器制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）功能化二维碳基材料/金属有机框架/多刺金纳米颗粒复合材料的制备：采用水热合成法处理二维碳基材料，称取10~20 mg二维碳基材料加入25~50 mL 0.01~0.02 M pH值为7.0~9.0缓冲液中，超声处理1~3 h，随后，称取5~10 mg羟氨基官能化材料单体添加到二维碳基材料分散液中，用高纯中性气体将溶液脱气10~20 min，在冰浴条件下将上述溶液超声处理10~20 min，然后在50~70℃下反应24~30 h以获得羟氨基功能化二维碳基材料的黑色悬浮液，最后，在8000~10000 rpm转速下离心3~5次收集产品，在60~70℃下干燥至恒重；采用溶剂热法合成氨基化金属有机框架，称取0.1~0.3 g聚乙烯吡咯烷酮溶于4.5~13.5 mL分散剂中，再称取100~150 mg六水合硝酸类金属化合物，30~50 mg 2-氨基对苯二甲酸和40~100 µL三乙胺的混合物添加到上述溶液中，并超声处理20~30 min，之后，将均相溶液置入高压釜中于105~125℃反应18~24 h，冷却至20~25℃后，在8000~10000 rpm转速下离心并用分散剂、乙醇洗涤3~5次收集产物，最后在60~70℃干燥至恒重；采用种子介导生长法和柠檬酸盐还原法制备多刺金纳米颗粒，量取2~4 mL 0.01~0.03 M氯金酸溶液，加入6~8 mL 质量百分比为5~8%的柠檬酸钠溶液，量取500~800 μL上述溶液添加到2~4 mL水溶液中，并用6~8mL 质量百分比为5~8％的柠檬酸钠溶液调节pH 值为6.0~8.0，在轻微摇动下，将0.3~0.5mL 0.01~0.03 M氯金酸溶液添加到上述混合物中，溶液的颜色从浅粉红色变浅紫色，在5000~8000 rpm转速下离心7~10 min收集得到的多刺金纳米颗粒，用水洗涤3~5次后分散到水中；采用物理吸附法制备复合材料，称取上述4~8 mg功能化二维碳基材料溶解于2~4 mL的蒸馏水中，加入500~1000 μL上述多刺金纳米颗粒溶液和500~1000 μL 2~5 mg·mL^-1上述金属有机框架溶液，将上述混合液置于摇床上震荡12~14 h，干燥即得到功能化二维碳基材料/金属有机框架/多刺金纳米颗粒复合材料；

（2）信号分子/金纳米粒子/介孔金属氧化物纳米球/DNA-1信号标签的制备：采用一步溶剂热法合成介孔金属氧化物纳米球，称取2~4 g无水金属氯化物添加到40~80 mL乙二醇中并溶解，称取6~10 g无水乙酸钠和20~35 mL氨基官能化溶液加入上述溶液中并剧烈搅拌30~60 min，将混合溶液倒入反应釜加热至180~250°C持续8~12 h，冷却至20~25℃后，将沉淀物用大量超纯水洗涤至中性，最后将产品在50~70℃下干燥；采用化学键合法合成金纳米粒子/介孔金属氧化物纳米球，称取5~10 mg介孔金属氧化物纳米球分散在5~10 mL蒸馏水中，在剧烈搅拌下将10~15 mL 15 mM氯金酸溶液和2~5 mL 质量百分比1~3％的还原剂加入上述溶液中，在8000~12000 rpm转速下离心5~10 min收集产物并用乙醇洗涤3~5次；采用化学键合法合成信号分子/金纳米粒子/介孔金属氧化物纳米球/DNA-1信号标签，量取1~3 mL0.3~1 mM信号分子溶液加入到3~6 mL金纳米粒子/介孔金属氧化物纳米球溶液中，并在4~8°C下柔和搅拌12~16 h，在8000~12000 rpm转速下离心5~10 min收集产物，在60~70°C下干燥16~20 h，将收集的信号分子/金纳米粒子/介孔金属氧化物纳米球添加到2~6 μM 0.5~1mL巯基修饰的金属离子依赖性DNA酶底物链DNA-1中，在摇床上振荡反应8~16 h，最后，加入100~200 μL 质量百分比0.1~0.25％牛血清白蛋白溶液振荡反应1~2 h，得到了信号分子/金纳米粒子/介孔金属氧化物纳米球/DNA-1信号标签；

（3）功能化二维碳基材料/金属有机框架/多刺金纳米颗粒复合材料/金属离子依赖性DNA酶/金电极的制备：用0.02~0.05 µm Al₂O₃粉末将直径为1~4 mm金电极抛光，然后依次在乙醇和双蒸馏水中超声处理，将其置于强氧化溶液中20~60 min，用蒸馏水冲洗干燥后，将2~5 μL功能化二维碳基材料/金属有机框架/多刺金纳米颗粒复合材料悬浮液滴加到金电极表面上，并在20~24°C下干燥，依次将3~5 μL 0.05~1 µg·mL^-1邻苯二甲酸二丁酯抗体溶液和5~10 μL信号分子/金纳米粒子/介孔金属氧化物纳米球/DNA-1滴加到电极上，在35~38°C下孵育1~2.5 h，移取3~10 μL 0.1~0.5 mM的封闭剂滴加在电极上，在35~38°C下孵育30~50min，在体外先将200~1000 μL 5~10 µg·mL^-1 DBP-BSA偶联物加入至200~1000 μL 2~6 μM氨基修饰的金属离子依赖性DNA酶DNA-2中，再加入50~100 μL 0.1~0.25%的戊二醛，在35~38°C下反应8~10 h，得到了DBP-BSA-DNA-2溶液，加入3~5 μL邻苯二甲酸二丁酯标准溶液和3~5 μL DBP-BSA-DNA-2的混合物，在35~38°C孵育30~60 min，加入3~10 μL 5~10 µg·mL^-1的金属离子溶液在35~38°C下反应30~60 min，得到功能化二维碳基材料/金属有机框架/多刺金纳米颗粒复合材料/金属离子依赖性DNA酶/金电极；

（4）电化学传感器是以功能化二维碳基材料/金属有机框架/多刺金纳米颗粒复合材料/金属离子依赖性DNA酶/金电极为工作电极，以铂丝电极为对电极，饱和氯化银为参比电极，通过信号分子响应信号的变化获得样本中邻苯二甲酸二丁酯的含量，从而得到了用于邻苯二甲酸二丁酯检测的电化学传感器。