[发明专利]一种增强CRISPR/Cas9系统基因编辑效率的方法

说明书

本发明涉及植物基因工程领域，尤指一种增强CRISPR/Cas9系统基因编辑效率的方法，本发明在PCR2后添加了一轮将U₃和U_6a的gRNA表达盒连接的PCR反应，然后再进行酶切连接，得到重组质粒；对U₃表达盒与U_6a表达盒连接，连接后的产物再与MH质粒连接，相对于现有技术同时将U₃表达盒、U_6a表达盒、MH质粒一起连接，本发明连接的难度远低于现有技术的连接难度，阳性克隆的比例大大增加，实现上述U₃表达盒和U_6a表达盒连接，重新设计了U₃表达盒的下引物B2‑M和U_6a表达盒的上引物B2’‑M，使B2‑M与B2’‑M的序列部分互补，这样可以使U₃表达盒和U_6a表达盒产物在第三轮PCR反应中通过粘性末端碱基互补连接起来。

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，尤指一种用于水稻或单子叶植物的增强CRISPR/Cas9系统基因编辑效率的方法。

背景技术

基因的多样性是研究植物性状和遗传的重要资源。千百年来，植物的驯化依赖于自然变异的人工选择，但此过程中变异的方向是随机的，变异的频率也很低。为了创制新的品种，育种学家们利用了各种方法向植物基因组中引入突变，包括物理诱变、化学诱变和生物诱变等，但是这些突变的方向都不能控制。如果可以对目标序列进行定点编辑，将对作物遗传改良和植物基因功能研究起着重要作用。

基因编辑技术是一种通过人工设计和改造核酸酶达到对基因进行定点修饰的技术。目前发展起来的基因编辑技术主要包括第一代的锌指核酸酶(ZFNs,zinc finernucleases)、第二代的转录激活子样效应子介导核酸酶(TALENs,transcriptionactivator-like effector nucleases)和近几年兴起的第三代CRISPR/Cas9系统。其中CRISPR/Cas9系统由于操作简单、设计灵活、价格低廉、能实现多点编辑、可扩展性强，成为应用最广、研究最透彻的系统。该系统有gRNA和Cas9蛋白两部分组成。gRNA首先通过自身的Cas9把手与Cas9蛋白形成复合体，然后复合体搜寻并匹配PAM序列，随后gRNA识别靶序列，最后Cas9蛋白对靶序列进行切割，形成DNA双链断裂(Double-strand break，DSB)(JinekM,Chylinski K,Fonfara I,et al.A programmable dual-RNA-guided DNA endonucleasein adaptive bacterial immunity.Science,2012,337:816–821)。

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，由于其基因组小、易于操作、遗传转化体系高效，适合用于基因编辑技术的研究。华南农业大学刘耀光院士团队开发了一套适合于植物的多靶点CRISPR/Cas9基因编辑载体系统(Ma X,Zhang Q,Zhu Q,et al.A robustCRISPR/Cas9 system for convenient,high-efficiencymultiplex genome editing inmonocot and dicot plants.Molecular plant,2015,8(8):1274-1284)，该方法可以同时编辑植物基因组的多个靶位点。当有两个靶点时，该方法通过一次Overlapping PCR分别得到U₃和U_6a表达盒，然后通过一次边切边连将U₃表达盒、U_6a表达盒和MH质粒三个片段连接在一起，由于T₄连接酶连接效率有限，经常出现只连接上了U₃、只连接上了U_6a或者空载的情况，导致阳性克隆的比例非常低，基因编辑效率较低。

发明内容