[发明专利]基于磁性生物复合材料的DNA酶和杂交链式反应的电化学生物传感器检测铅离子的方法

权利要求书

1.一种基于磁性生物复合材料的DNA酶和杂交链式反应双重放大的电化学生物传感器检测铅离子的方法，其特征在于包括如下步骤：

步骤(a)、构建磁性生物复合材料Fe₃O₄@Au NPs-S1：将Fe₃O₄@Au纳米粒与酶底物链S1共孵育，再加入6-巯基己醇共孵育；

步骤(b)、铅离子依赖性DNA酶的酶切作用：步骤(a)构建的磁性生物复合材料Fe₃O₄@AuNPs-S1、铅离子依赖性DNA酶S2、不同浓度的铅离子溶液共孵育；

步骤(c)、杂交链式反应的放大作用：步骤(b)得到的产物与发卡DNA链H1和发卡DNA链H2共同孵育反应；

步骤(d)、构建电化学生物传感器：步骤(c)得到的产物与亚甲蓝孵育反应得到样品，通过磁性诱导将样品吸附到磁性玻碳电极表面，测定亚甲蓝的DPV信号，建立标准曲线；

步骤(e)、样品检测：按照步骤(a)-步骤(d)测得未知浓度的待测铅离子样品的DPV信号，代入标准曲线得到样品中铅离子浓度；

其中，酶底物链S1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；铅离子依赖性DNA酶S2的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；发卡DNA链H1的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；发卡DNA链H2的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；酶底物链S1为核酸序列，其序列中包含铅离子依赖性DNA酶S2的底物序列以及杂交链式反应的引发序列，从而使得酶底物链S1被铅离子依赖性DNA酶酶切时，杂交链式反应的引发序列从磁性生物复合材料上脱落，杂交链式反应无法被触发。

2.根据权利要求1所述的基于磁性生物复合材料的DNA酶和杂交链式反应双重放大的电化学生物传感器检测铅离子的方法，其特征在于步骤(a)-步骤(d)中，以pH 7.4,20mMTris-HCl,100mM NaCl的缓冲液为反应体系；步骤(a)-步骤(c)中，每次孵育后磁性分离出产物。

3.根据权利要求1所述的基于磁性生物复合材料的DNA酶和杂交链式反应双重放大的电化学生物传感器检测铅离子的方法，其特征在于步骤(a)中，Fe₃O₄@Au纳米粒由Fe₃O₄-APTES与HAuCl₄制得。

4.根据权利要求1所述的基于磁性生物复合材料的DNA酶和杂交链式反应双重放大的电化学生物传感器检测铅离子的方法，其特征在于步骤(a)中，酶底物链S1的浓度为0.05～0.5μM；Fe₃O₄@Au纳米粒的固含量为0.2～0.6mg/mL；酶底物链S1和Fe₃O₄@Au纳米粒的孵育时间为2h，温度为37℃；

6-巯基己醇的浓度为0.05～0.5mM，6-巯基己醇和Fe₃O₄@Au纳米粒的孵育时间为1h，室温。

5.根据权利要求1所述的基于磁性生物复合材料的DNA酶和杂交链式反应双重放大的电化学生物传感器检测铅离子的方法，其特征在于步骤(b)中，铅离子依赖性DNA酶S2的浓度为0.05～0.5μM，酶底物链S1与铅离子依赖性DNA酶S2的浓度比为1:0.25～3。

6.根据权利要求5所述的基于磁性生物复合材料的DNA酶和杂交链式反应双重放大的电化学生物传感器检测铅离子的方法，其特征在于步骤(b)中，酶底物链S1与铅离子依赖性DNA酶S2的浓度比为1:1。

7.根据权利要求1或5所述的基于磁性生物复合材料的DNA酶和杂交链式反应双重放大的电化学生物传感器检测铅离子的方法，其特征在于步骤(b)中，磁性生物复合材料Fe₃O₄@Au NPs-S1、铅离子依赖性DNA酶S2和铅离子的孵育时间为10～50min，温度为35～40℃。