[发明专利]一种产甘露聚糖的重组大肠杆菌及其应用

说明书

本发明公开了一种产甘露聚糖的重组大肠杆菌及其应用，属于生物工程技术领域。本发明采用来源于植物瓜尔豆的甘露聚糖合酶基因ManS，将其整合至T7启动子控制的pET21a质粒，将重组质粒在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中实现了甘露聚糖的异源合成，产量可以达到0.68g/L。本发明为微生物利用廉价碳源高效发酵制备甘露聚糖奠定了一定的基础，适合于工业化生产应用。

技术领域

本发明涉及一种产甘露聚糖的重组大肠杆菌及其应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

甘露聚糖是一种半纤维素聚多糖，广泛存在与多种生命形式中。甘露聚糖作为一种优良的低热量、高纤维素的水溶性膳食纤维，被广泛应用于食品和医药等行业。甘露聚糖因其独特的分子结构和理化性质而具有独特的生物活性，能在机体内参与一些十分重要的生理过程，如刺激机体免疫应答，促进肠道内有益菌的营养生长，降低血清胆固醇含量等。

甘露聚糖广泛存在于魔芋粉、瓜尔豆胶、田著胶和石斛等植物体及多种微生物细胞壁内，当前商品化的甘露聚糖主要从魔芋和酵母细胞中提取而来。魔芋甘露聚糖提取分离工艺复杂，收率和纯度低；且魔芋甘露聚糖分子量高、粘稠度大，提纯后的产品还需要进一步通过降解制备为低聚甘露糖使用，产品质量不够稳定。尽管近些年来也有采用啤酒酵母进行发酵，从细胞壁中提取甘露聚糖，但局限于其产量水平很低以及复杂的提取工艺，难以实现工业化规模生产。因此，通过代谢工程手段实现异源重组高效微生物发酵法生产甘露聚糖被视为最有希望的一条替代生产途径。

发明内容

为了解决目前存在的问题，本发明提供了一种产甘露聚糖的重组大肠杆菌，是在大肠杆菌中完善甘露聚糖合成途径，实现了从葡萄糖为碳源开始直接发酵产甘露聚糖。

本发明在原核宿主大肠杆菌中构建甘露聚糖代谢合成途径，实现分泌合成甘露聚糖，基于大肠杆菌高效生产效率和易于培养等特性，适用于进行大规模发酵，产品易于分离纯化。该发明操作过程简单，且产品纯度高，易于实现工业化生产制备甘露聚糖。

本发明提供一种产甘露聚糖的重组大肠杆菌，所述大肠杆菌表达甘露聚糖合酶基因ManS，并过表达GDP-甘露糖焦磷酸化酶基因manC和磷酸甘露糖酶基因manB。

在本发明的一种实施方式中，以E coli BL21(DE3)为出发菌株。

在本发明的一种实施方式中，所述甘露聚糖合酶基因ManS为来源于瓜尔豆的甘露聚糖合酶基因ctManS。

在本发明的一种实施方式中，所述GDP-甘露糖焦磷酸化酶基因manC和磷酸甘露糖酶基因manB来源于E coli BL21(DE3)。

在本发明的一种实施方式中，所述ManS的GeneBank登录号为：AY372247.1。

在本发明的一种实施方式中，所述manC的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述manB的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在本发明的一种实施方式中，以pET21a为表达载体。

本发明还提供一种生产甘露聚糖的方法，在含有碳源的体系中，以IPTG作为诱导剂，以所述重组大肠杆菌为发酵菌株，在25～35℃下发酵45～50h。

在本发明的一种实施方式中，碳源选自：生物质碳源、蔗糖、果糖、葡萄糖中的一种或多种。

在本发明的一种实施方式中，将重组大肠杆菌活化得到菌液，将菌液接种于发酵培养基，在180～220rpm、25～35℃中培养至OD₆₀₀为0.5～1.0，加入终浓度0.05～0.2mM的IPTG作为诱导剂，诱导培养45～50h。

本发明保护所述重组大肠杆菌，或生产甘露聚糖的方法在化工领域制备甘露聚糖中的应用。