[发明专利]特异性检测BRAF基因突变的抗体及其在制备癌症检测试剂盒中的用途

说明书

本发明涉及特异性检测BRAF基因突变的抗体及其在癌症检测中的用途。本发明采用600E多肽进行单克隆抗体的制备，并且以V600作为反筛蛋白最终得到了特异性针对600E突变的多肽的单克隆抗体，并且将该单克隆抗体通过磁珠进行偶联后，能够特异性的检测600E突变的细胞具有较好的特异性和准确性，具有较好的应用前景。

技术领域

本发明涉及抗体领域，更具体的涉及特异性检测BRAF基因突变的抗体及其在制备癌症检测试剂盒中的用途。

背景技术

RAF基因是一种广泛存在于哺乳动物中的最重要的原癌基因之一，有ARAF、BRAF、CRAF3种亚型。其中BRAF具有最强的激酶活性，由18个外显子组成，编码蛋白约94kDa;由于第15外显子的单个碱基发生胸腺嘧啶(T)和腺嘌呤(A)的错义突变，导致翻译蛋白600位密码子的缬氨酸被谷氨酸取代，产生蛋白序列改变，即V600E突变。除V600E突变外，BRAF基因的外显子15中测到许多独特且罕见的非热点突变，如T599I、T599dup、K601E。BRAF基因V600E突变导致KRAS/BＲAF/MAPK通路传导异常，引起细胞过度增殖和分化而诱发肿瘤，并对肿瘤的增殖、侵袭和转移发挥重要作用。

研究表明，在结肠腺癌中BRAF基因V600E突变提高了ERK、NFκB活性和小鼠胚胎NIH3T3细胞转化能力;研究采用RNA干扰(RNAi)技术抑制BＲAF基因V600E的表达，能够有效降低MAPK活性，从而抑制细胞生长和促进凋亡，明确了BRAF基因对细胞具有调控作用。现有临床证据表明，BRAF基因V600E突变对结肠癌具有明确的预后价值;因BRAF基因V600E突变型结肠癌的恶性程度高、淋巴结转移率高，常导致较差的临床结果。Ahn等报道，BRAF基因V600E突变患者5年生存率明显降低，与结肠癌的临床病理特征无关，但BRAF基因V600E突变型可能是预后不良的重要因素之一。研究表明，BRAF基因野生型结肠癌患者可以从抗EGFR单克隆抗体治疗中获益，无进展生存期和总生存期明显优于突变型。

BRAF V600E突变会促进促甲状腺素受体(TSHR)基因启动子甲基化，导致TSHR沉默或者表达显著下降，使促甲状腺素(TSH)反馈性升高，促进肿瘤细胞的生长。BRAF V600E基因突变协同端粒酶反转录酶(TERT)启动子突变也在PTC的发生中发挥着重要作用，二者共同存在于PTC的比例为7%～8%，其可能的机制是异常激活BRAFV600E-MAPKFOS-GABP-TERT信号转导通路，经BRAF V600E激酶磷酸化的低聚果糖(FOS)在此通路上发挥了重要作用。此外，BRAF V600E突变通过癌基因MYC以非TERT启动子突变依赖性的方式上调TEＲT表达同样促进了PTC的发生。Xing等研究发现，同时携带有BRAF和TERT两种突变会导致PTC患者的复发和死亡风险急剧上升。上述研究表明BRAF V600E突变是PTC形成与进展过程中的重要分子改变，为PTC的诊断及靶向治疗提供了理论基础。

基于BRAF基因突变与肿瘤的关系，研究黑素瘤BRAF基因突变的检测方法变得尤为重要。测序是最直接的BRAF基因突变检测方法。第一代测序法又称直接测序法，包括Sanger测序法和焦磷酸测序法。第二代测序法（nextgenerationsequencing,NGS）简称NGS，通过片段化DNA及荧光标记PCR等技术实现了高通量测序。NGS对样本DNA的含量和质量要求较高。Larsen等在对黑素瘤的突变检测中发现，因福尔马林固定石蜡包埋切片（FFPE）储存时间过长而导致的DNA降解会影响PCR的过程。组织内黑素沉积过多也会影响PCR过程。此外，在NGS检测中，V600E与V600K存在交叉反应，并存在与V600R等其他突变发生交叉反应的现象。