[发明专利]一种纳米尺度单外泌体分离方法

说明书

本发明公开了一种纳米尺度单外泌体分离方法，将含有外泌体的细胞培养液充分稀释；加入超顺磁性氨基磁珠稀释液低频振荡混合，待纳米磁珠与外泌体发生偶联；将偶联液移至纳米孔阵列微芯片表层；将微芯片置于摇床上，进行低速小角度振荡，使偶联液均匀分布于芯片表层；在微芯片下表面放置磁源，使用渐进式磁力吸附方式，使磁珠外泌体偶联体进入纳米孔阵列；在更大磁力作用下，保持磁珠外泌体偶联体的稳定吸附，利用缓冲液清洗基片的上表面，静置后得到含有单外泌体的纳米微芯片，即可直接用于后续检测。本发明基于具有高精密筛作用的纳米孔微列微芯片，通过磁珠偶联外泌体、渐进磁力吸附，可实现高纯度单外泌体获取。

技术领域

本发明属于单外泌体分析技术领域，具体涉及一种纳米尺度单外泌体分离方法。

背景技术

外泌体(Exosome)是指由(绝大多数)细胞向外分泌的直径约为30～150nm的生物活性囊泡。外泌体具有典型的脂质双分子层膜结构，携带了分泌母细胞的多种蛋白质、脂类、核酸等重要信息，是细胞之间信息交流的重要载体和关键信使，在生物分子的转移以及各种疾病的生理和病理过程中具有重要作用。

当前，外泌体的分离技术主要包括超速离心法、超滤离心法、微流道法、磁珠免疫法等。超速离心法是最常用的外泌体纯化手段，通过高速离心将不同尺寸的囊泡颗粒从可溶性分子中沉淀并纯化出来，但重复离心操作很可能对外泌体的囊泡造成损害从而降低其质量。超滤离心法是利用相对分子质量的差异对样品进行选择性分离，该方法简单高效，且不影响外泌体的生物活性，但是过滤孔易阻塞，导致膜的寿命减短，分离效率较低。微流道法基于粘弹性流动、纳米线陷阱等的原理，通过声学、电学和电磁学操控实现了不同尺度外泌体的有效分离，该方法具消耗极少、分离度高、成本低等优势，但微流道直径通常在微米级以上，难以实现纳米尺度单外泌体的分离。

磁珠免疫法是一种免疫亲和技术，外泌体的蛋白质表面具有特异性受体，通过带有对应修饰物抗体的纳米颗粒从样本中捕获不同类型的外泌体，从而实现外泌体进行选择性分离，该方法具有高特异性、可获得高纯度的外泌体等优点，但是缺乏适当的载体承载分离得到独立的单外泌体，导致分离得到单外泌体的效率和分散度并不高。

CN 109576210 A所公布的快速分离外泌体的方法，该方法通过在超顺磁性纳米颗粒和配体之间构建柔性结构单元，有效提高了从血清中分离外泌体的效率，但是该方法所得超顺磁纳米颗粒-聚乙二醇-配体复合物为高纯度团簇，需要后续进一步分散和处理才可获得单一独立外泌体。CN 109266599 A所公布的一种高效形貌无损的外泌体分离方法，该方法利用修饰有核酸适配体的磁珠识别并捕获外泌体样本，重点在于利用核酸适配体的互补链替换释放外泌体，但是该方法在磁珠和外泌体样本共孵育过后仍采用静置提取沉淀来获得磁珠-外泌体复合物，分散效率低，无法直接用于后续检测。

目前，纳米尺度单外泌体的分离和检测面临着挑战和瓶颈，亟须开发单外泌体的精准分离方法，特别的，在通过磁珠免疫法实现外泌体的特异性分离和精准捕获的基础上，缺乏适当的载体承载分离得到独立的单外泌体，导致分离得到单外泌体的效率并不高，若将磁珠免疫法与微纳分离筛选芯片相结合，可以为提升分离效率并获得稳定分布的纳米尺度单外泌体提供可行方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种纳米尺度单外泌体分离方法，用于高纯度单外泌体获取，具有高产出、低耗时、低成本和易操作的特点，分离完成的含有单外泌体的纳米孔阵列微芯片可直接用于下一步检测，为突破纳米尺度单外泌体分离及测序前的瓶颈提供可行方法。

本发明采用以下技术方案：

一种纳米尺度单外泌体分离方法，包括以下步骤：

S1、将经过生物提取的含有外泌体的细胞培养液充分稀释得到待分离外泌体样液；

S2、向步骤S1制备的待分离外泌体样液中加入超顺磁性氨基磁珠稀释液，采用低频振动混合方式使纳米磁珠与外泌体充分偶联制得偶联液；