[发明专利]一种因子法体外高效扩增NK细胞的方法

权利要求书

1.一种因子法体外高效扩增NK细胞的方法，其特征在于：其方法包括以下步骤：

步骤1：细胞分离

将淋巴细胞分离液和外周血全血混合，进行一次离心操作，离心后吸取血浆，吸取白膜层PBMCs至离心管，向离心管内补加生理盐水，进行二次离心操作，离心后弃上清液，拍散细胞，加入生理盐水，混匀细胞后再次补加生理盐水，进行三次离心操作，离心后弃上清液，拍散细胞，加入生理盐水，混匀细胞再次补加生理盐水，进行四次离心操作，取适量细胞用于细胞培养；

步骤2：细胞接种与激活

将步骤1制备的细胞，用NK激活培养基调整细胞密度为200万/ml,培养瓶竖直放置；

步骤3：换液

步骤2细胞培养72h后，吹打混匀细胞，取样计数，然后将细胞转移至离心管，进行离心操作，离心后用NK扩增培养基调整细胞密度为100万/ml；

步骤4：细胞扩增

隔天对步骤3培养细胞观察细胞状态，当集落较多且培养基颜色变黄进行补液，吹打混匀细胞，取样计数，补加新鲜的NK扩增培养基，使最终细胞密度为80-100万/ml。

2.根据权利要求1所述的一种因子法体外高效扩增NK细胞的方法，其特征在于：所述NK激活培养基包括X-VIVO无血清培养基、CD16单抗、NKP46单抗、OK432、IL-2、IL-15和体积分数为10％血清。

3.根据权利要求1所述的一种因子法体外高效扩增NK细胞的方法，其特征在于：所述NK扩增培养基包括X-VIVO无血清培养基、IL-2、IL-15、氢化可的松和体积分数为10％血清。

4.根据权利要求2所述的一种因子法体外高效扩增NK细胞的方法，其特征在于：所述NK激活培养基中CD16单抗浓度为50ng/ml、NKP46单抗浓度为50ng/ml、OK432浓度为0.02KE/ml、IL-2浓度为1000U/ml、IL-15浓度为30ng/ml。

5.根据权利要求3所述的一种因子法体外高效扩增NK细胞的方法，其特征在于：所述NK扩增培养基中IL-2浓度为1000U/ml、IL-15浓度为30ng/ml、氢化可的松浓度为10^-4uM/L。