[发明专利]一种根据人精子mRNA评估精子受精能力的方法

说明书

本发明公开了一种根据人精子mRNA评估精子受精能力的方法，包括精液标本采集、精子RNA提取、精子RNA测序、生物信息学分析、Real‑time PCR验证、统计学分析的步骤，本发明的方案选定3个单个外显子SPATA19,OSBP2和ACE作为衡量精子受孕潜力的生物标记物，并成功建立方程模型，利用这三个基因的CT值代入方程，计算每个样本得出的数值作为参考值，作为精子受孕潜能的评估数值。在双盲测试中，利用方程得出的结论与临床反馈精子受孕力契合度高于85％。本发明的实验结论充分说明精子所携带的RNA可以作为评估精子受孕潜力的生物标记物，并准确地去除受孕力及其低下的那部分供精，大大提高了精子库供精质量。

技术领域

本发明涉及医学检测技术领域，尤其涉及一种根据人精子mRNA评估精子受精能力的方法。

背景技术

辅助生殖技术的发展，已能帮助那些因严重男性因素导致不育的夫妇获得健康子代。然而迄今为止，尚缺乏有效的精子功能评估指标。生殖生物学和生殖遗传学的发展为评估精子结构和功能提供了许多值得借鉴的评估方法，如精子膜功能检测、顶体功能检测、线粒体功能检测、中心体功能检测及遗传物质完整性检测，但这些检测对精子功能评估的准确性非常有限，难以作为独立的临床指标，故寻找一种有效的评价精子功能方法可能更有助于临床实际。

生殖是一个复杂的生理过程，但人们对其中的生理、病理学机制认识有限，对男性不育的了解尤其有限。目前对于男性不育的疾病大多难以进行病因学分类并进行针对性诊疗。临床上已广泛采用WHO标准精液分析，项目包括精子密度、活力和形态学检查等，作为评估男性生育力的重要指标。但它们仅仅是关于精液中活动的结构上正常的精子数量上的浅表的分析，对精子功能和受精潜能，则所提供的信息是有限的，不能对男性生育力提供精确的诊断及预后估计。

人类成熟精子中RNA的存在已经被证实，主要包括mRNA和非编码RNA家族成员。随着研究深入，发现精子mRNA表达差异，与精子活力和男性生育功能相关。而部分精子中特异存在的mRNA和小RNA在精卵融合和早期胚胎发育调控中有重要作用。已经获得的结果提示精源性RNA的表达具有个体差异性，并且是胚胎发育所必需的。对精子RNA功能的深入研究将会对男性不育、人类辅助生育技术以及核移植技术等相关领域产生推动作用，如何根据这些研究选择出适合临床检测使用的标志物，建立一种临床应用价值大的精子功能检测方法是目前男性生殖医学转化医学研究的重点。

发明内容

有鉴于此，本发明所解决的技术问题在于提供了一种根据人精子mRNA评估精子受精能力的方法，以精子所携带的RNA可以作为评估精子受孕潜力的生物标记物，能够非常准确地去除受孕力及其低下的那部分供精，大大提高了精子库供精质量。

为此，本发明公开如下技术方案：

一种根据人精子mRNA评估精子受精能力的方法，包括如下步骤：

(1)精液标本采集及冷冻：统计妊娠满5例及妊娠≤2例的精液样本外供周期数据分布情况，据此制订高受孕力组及低受孕力组，让捐精者通过手淫取精，再使用“一步薰蒸法”进行精液冷冻；

(2)精子RNA提取：用试剂盒mirVana RNA isolation kit提取精子RNA；

(3)精子RNA测序：用提取到的10例高受孕力和10例低受孕力精子总RNA100ng按照BGI HiSeq Strand-Specific Transcriptome library方法构建cDNA文库，应用BGI HiSeq2500PE126测序平台进行RNA测序；

(4)生物信息学分析：将测序获得的数据进行生物信息学分析，获得高、低生育率组差异表达的mRNA；

(5)Real-time PCR验证：将提取到精总RNA用DNase I消化去除基因组DNA，反转录后，用2.5倍体积去离子水稀释cDNA作为q-PCR模板，进行定量PCR检测；