[发明专利]基于CRSIPR-Cas9与类器官培养的三体综合征基因核酸检测质控品及其制备方法

说明书

本发明提供一种基于CRSIPR‑Cas9与类器官培养的三体综合征基因核酸检测质控品，用于全方位监测三体综合征基因检测的过程。步骤如下：(1)利用CRISPR‑Cas9技术对三体综合征患者来源的外周血淋巴细胞进行端粒酶TERT的敲入表达，构建可稳定扩增分裂的基因编辑淋巴细胞；(2)构建全新类器官培养体系，对前述基因编辑后淋巴细胞进行大规模扩增，并通过染色体核型分析验证扩增细胞染色体畸变状态的维持情况；(3)将产品与野生型人源性淋巴细胞按特定比例混合，精确定量验证后即制得本发明，其基础生物学遗传背景与实际患者更接近，相较于普通患者来源质控物的基因组稳定性更高，实现三体综合征基因检测的全方位监控。

技术领域

本发明属于13、18、21三体综合征特征基因核酸检测领域，尤其涉及一种基于CRSIPR-Cas9与类器官培养的三体综合征基因核酸检测质控品及其制备方法。

背景技术

染色三体综合征是当前优生优育政策的大敌，最常见的三体综合征为13、18、或21三体综合征，其发病机制主要是指胎儿染色体上多了一条特定染色体所致的先天性疾病。多数患儿会在妊娠早期发育停止，进而造成流产；但仍有小部分受精卵可发育成熟，最终导致患儿出生。患儿出生后智力发育受限，显著低于一般同龄儿童。由于此类患儿智力低下，发育迟滞，对家庭和社会造成极大负担。因此，三体综合征已成为当前产前诊断筛选的重中之重。尽管三体综合征发病机制还不清楚，但母亲的生育年龄与三体综合征的发生频率具有显著相关性。研究表明，35岁以下母亲，其发生率不到0.1％，此后发生率随着母亲年龄的增大而上升。鉴于三体综合征发生的具体原因仍不明确，从源头阻断此疾病发生目前仍是难以攻克的困境。因此在产前阶段，对针对全体孕妇进行有效筛查，提早发现三体综合征患儿，尽早采取干预措施，对于预防患儿出生，减轻家庭、社会负担具有重要现实意义。

目前三体综合征的分子诊断主要有两种途径：一种是基于羊水细胞的染色体检查；另一种是基于母体循环内胎儿游离DNA的核酸检查。前者对采样要求极高，且具有一定的不良事件发生率；此外检测的实验室室内与室间变异度仍难以有效控制。后者尽管具有高度的安全性，可有效避免采样对胎儿的影响，但是对检测精度与灵敏度具有非常严苛的要求。由此可见一款稳定、性能优异的质控产品对于切实提高三体综合征核酸检测结果的准确性具有重大价值。目前尽管有少部分欧美厂商运用三体综合征患儿的淋巴细胞制备了相关质控产品。但是，此类产品存在批次间精密度不均一的特点，严重掣肘临床大规模应用。因此，开发全新稳定，高重复性的三体质控产品是产前诊断领域的热点与重点。

CRISPR-Cas9是目前已成为生物工程领域中最常用的基因编辑工具。近年来，随着技术研发的进展，以CRIPSR-Cas9技术为基础的基因全长敲入表达已成为现实。相较于普通的质粒表达体系，其具有更高的表达效率与更低的错误发生率，可稳定维持特定基因的高效、持久表达，故尤其适合用于构建永生化人源性淋巴细胞。

类器官培养是近年来兴起的一种全新体外活体细胞培养与扩增模式。相较于经典2D贴壁培养系统，类器官一方面具有构建成功率高的特点，可长期、低成本、快速培养；另一方面，类器官培养可保留原始细胞的基因组、蛋白组等分子特征，在扩增过程中不会丢失原有细胞的关键性分子遗传背景，可为后续研究或生产提供更真实的细胞环境。

发明内容

本发明所解决技术问题是提供一种基于CRSIPR-Cas9与类器官培养的三体综合征基因核酸检测质控品及其制备方法，结合CRSIPR-Cas9技术与类器官培养技术，高保真地扩增特定遗传背景细胞，可极为真实地模拟实际临床样本的检测流程，实现三体综合征核酸检测的全方位监控；成本低廉、稳定性高、便于储存与转运等优势，便于工业级别的大规模生产；具有重要的价值与应用前景。

为解决上述技术问题，本发明提供一种基于CRSIPR-Cas9与类器官培养的三体综合征基因核酸检测质控品，用于全方位监测三体综合征基因检测的过程。

本发明还提供一种基于CRSIPR-Cas9与类器官培养的三体综合征基因核酸检测质控品的制备方法，制备步骤如下：