[发明专利]H7和N2亚型禽流感病毒双重纳米PCR检测的引物组、试剂盒及方法

说明书

本发明提供了H7和N2亚型禽流感病毒双重纳米PCR检测的引物组、试剂盒及方法，本发明设计针对H7和N2亚型AIV基因的特异性引物，经过对不同引物组合进行试验筛选得到扩增效果较好的一个引物组合，然后继续对反应体系中引物浓度、引物之间的比例、退火温度和扩增时间进行优化，最终建立起可同时检测H7和N2亚型AIV的方法。本发明的引物和检测方法通过一次纳米PCR反应便可同时确定样品中H7与N2亚型AIV的混合感染及单一感染情况，特别是采用了纳米PCR这种新型的PCR技术，比普通PCR更敏感，比实时荧光定量PCR更方便快捷。该方法同时具有特异性强，检测灵敏度高，快速简便及易于操作等优点，十分适于在基层单位应用推广，为H7与N2亚型AIV的监测及其防控提供技术支撑。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及H7和N2亚型禽流感病毒双重纳米PCR检测的引物组、试剂盒及方法。

背景技术

禽流感是由禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)引起的一种高度传染性疫病，在全球范围内持续传播。禽流感病毒是正黏病毒科成员，根据其表面抗原血凝素蛋白(Hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶蛋白(Neuraminidase,NA)的差异可以将AIV划分为18种不同的HA亚型(H1～H18)和11种不同的NA亚型(N1～N11)。HA和NA之间可以自由组合，理论计算流感病毒的亚型有198种。另外，依据其致病力的不同，还可将AIV分为高致病性AIV(HPAI)和低致病性AIV(LPAI)。

H7亚型病毒有9种不同亚型组合，已知的亚型包括H7N1、H7N2、H7N3、H7N4、H7N5、H7N6、H7N7、H7N8和H7N9。在世界各地的野生鸟类和家禽中发现的大多数H7病毒是LPAI病毒。H7病毒感染在人类中是罕见的。与人类感染相关的最常见H7病毒是亚洲谱系的A型禽流感(H7N9)病毒，2013年首次在中国发现。虽然人类感染很少，但这些感染通常导致严重呼吸道疾病和死亡。H7N2在美国东北部的活禽市场流行数十年，2002年在火鸡中大规模暴发，80位职业人群均出现流感样症状，并检测到H7N2的抗体，这也是北美地区首次证明北美谱系的H7病毒(LPAI H7N2)感染人。2003年从美国一名住院的免疫受损患者的呼吸道分离到一株H7N2病毒，2007年英国威尔士农场发现H7N2亚型禽流感病毒，2012年～2015年从浙江和湖南省活禽市场分离到的3株鸭源H7N2亚型AIV，2013年3月31日中国的上海和安徽两地首次发现人感染新型重配H7N9病毒的报道，至目前已经造成1568人感染，提醒我们H7亚型禽流感病毒特别是H7N2亚型AIV对养禽业和公众健康的威胁不容忽视。因此建立能迅速、有效的鉴别H7和N2亚型禽流感病毒的检测方法对于禽流感的防控及保证人类健康的安全具有重要意义。

目前，禽流感病毒实验室检测技术主要包括病毒的分离及培养、血清学试验、分子生物学实验和免疫荧光等方法，且病毒的分离与培养是诊断禽流感病毒感染的“金标准”。由于禽流感亚型众多且新的变异株不断出现，使用上述检测方法对其进行分型和诊断不仅存在着操作方法复杂，而且检测周期长及容易受抗体等因素影响使得检测结果不能准确和及时。纳米技术是20世纪80年代后期诞生并发展起来的一个新兴、高科技领域，是利用纳米科学知识研究纳米尺度物质的特性和相互作用，以及利用这些特性和现象的多学科的科学和技术。纳米PCR技术是在PCR反应的buffer中添加一定量的粒径为1～100nm的纳米金属颗粒，从而形成纳米流体，纳米流体具有极高的导热性，比普通流体要高得多，因此在添加了纳米金属颗粒的PCR热循环中，PCR反应能够更快地达到目标温度，从而缩短了在非目标温度停留的时间，不仅减少了非特异扩增，也提高了反应的特异性。随着纳米PCR技术的发展，人们不断地进行改良和优化。目前，纳米PCR技术检测动物病毒已经有报道，而双重纳米PCR(nano-dPCR)技术反应同时扩增H7和N2基因来检测和鉴别H7N2亚型AIV的核酸检测技术尚未见有报道。

发明内容

本发明的目的是提供H7和N2亚型禽流感病毒双重纳米PCR检测的引物组、试剂盒及方法。