[发明专利]表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测轮状病毒的方法

权利要求书

1.一种表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测轮状病毒的方法，其特征在于，所述表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测轮状病毒的方法包括以下步骤：

S1，轮状病毒抗体分组，将获得的一对轮状病毒抗体所包含的轮状病毒标记抗体和轮状病毒捕获抗体两个轮状病毒抗体进行独立存放备用；

S2，制备纳米材料，首先选择S1步骤其中一个轮状病毒抗体，并利用柠檬酸钠还原法制备出20—35nm的Au NPs胶体金溶液；然后在Au NPs胶体金溶液中加入8—12mM的DTNB，搅拌反应3—6h；离心弃上清，用去离子水重悬至原始体积，制备得到Au/DTNB NPs；最后取Au/DTNB NPs搅拌加热至煮沸，加入0.5—1.5%（w/v）的柠檬酸钠溶液，随后滴加0.5—1.5mM硝酸银溶液，持续沸腾10—20分钟，得到Au/DTNB@Ag NPs，再向Au/DTNB@Ag NPs中加入10mM的DTNB，搅拌反应3.5—5.5h，即可得到Au/DTNB@Ag/DTNB NPs纳米材料；

S3，制备SERS标记检测探针，首先向S2步骤制备的Au/DTNB@Ag/DTNB NPs纳米材料中加入EDC和NHS进行活化，活化后离心弃上清，然后用1.5—2.8mM的硼酸钠缓冲液重悬沉淀，加入轮状病毒抗体孵育1.3—2.5h；然后加入BSA进行封闭，封闭完成后离心弃上清，最后加入用SERS检测探针复溶液重悬，即制备得到轮状病毒特异性SERS标记分子，然后对轮状病毒特异性SERS标记分子稀释至所需浓度均匀的喷涂于结合垫上并在20—40℃恒温环境下干燥3h后，得到SERS标记的轮状病毒抗体检测探针；

S4，制备拉曼免疫层析试纸条，首先将S1步骤剩余的另一个轮状病毒抗体和羊抗鼠抗体进行稀释作业，然后分别喷涂在硝酸纤维素膜上并在30—40℃恒温环境下干燥，其中轮状病毒抗体检测探针作为检测线（T），羊抗鼠抗体作为质控线（C），然后将干燥后的硝酸纤维素膜与S3步骤制备的含SERS标记的轮状病毒抗体检测探针的结合垫同时与吸水纸及样品垫一同叠压并安装在PVC底板，在进行裁切作业即可得到成品试纸条，最后将制备的试纸条分别装入卡壳内并置于燥环境密封备用；

S5，试纸条性能检测，一方面采用国家标准品对S4步骤所制备试纸条的灵敏度、特异性、重复性和稳定性进行考察；另一方面通过临床样品对S4步骤所制备检测试纸条的检测性能进行比对检测；从而对S4步骤所制备检测试纸条检测性能进行全面评测。

2.根据权利要求1所述的一种表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测轮状病毒的方法，其特征在于，所述S3步骤中，EDC使用量为2.0—3.5μL；NHS使用量为2.0—3.5μL ；BSA使用量为90—120ml；所述S4步骤中轮状病毒抗体检测探针稀释后浓度为0.3—0.7mg/mL；羊抗鼠抗体稀释后浓度为0.3—0.7mg/mL。

3.根据权利要求1所述的一种表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测轮状病毒的方法，其特征在于，所述S4制备的试纸条从上至下依次为吸水纸、样品垫、结合垫与硝酸纤维素膜及PVC底板。

4.根据权利要求1或3所述的表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测轮状病毒的方法，其特征在于，所述试纸条优化宽度为2—4cm，优化长度为5—10厘米。

5.根据权利要求1所述的一种表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测轮状病毒的方法，其特征在于，所述S5步骤中，灵敏度检测的具体方法为：

使用试纸条检测轮状病毒国家标准品，分别稀释轮状病毒国家标准品至10、50、100、500、1000、5000、10000、50000、100000倍，加入至试纸条，10-15分钟观察结果，拉曼光谱仪器检测每个试纸条上拉曼信号。