[发明专利]一种低Vero细胞残留DNA狂犬病疫苗原液的制备方法

说明书

本发明公开了一种低Vero细胞残留DNA狂犬病疫苗原液的制备方法，具体制备步骤包括：细胞复苏；细胞传代；生物反应器培养；接种病毒；病毒收获；Mustang Q XT140膜层析处理；超滤浓缩及灭活；Sepharose 4FF凝胶层析。其中，用Sepharose 4FF凝胶层析为：按柱床体积5～10％进行上样，以0.01M磷酸盐缓冲液洗脱，收集蛋白峰；其中，病毒收获为：当抗原含量≥0.3IU/mL时，开始收获，并进行灌流补液，连续收获连续补液；并将收获的所述病毒液用玻璃纤维滤芯进行过滤，去除细胞碎片。本发明制备工艺可有效去除过程中的DNA杂质，使产品得到有效的纯化。

技术领域

本发明涉及狂犬病疫苗纯化领域，具体是一种低Vero细胞残留DNA狂犬病疫苗原液的制备方法。

背景技术

狂犬病疫苗的发展情况，经历了三类制备方法，分别为：神经组织疫苗、原代细胞疫苗、人二倍体细胞疫苗(human diploid cell vaccine，HDCV)和传代细胞培养疫苗(cellculture rabies vaccines，CCV)。神经组织疫苗因其副反应严重，已经停止使用；原代细胞疫苗生产过程中易引入外源污染；人二倍体细胞疫苗产率低成本高，限制了其应用；WHO在上世纪八十年代向发展中国家推荐了用Vero细胞制备狂犬病疫苗的方法。目前，我国市场上有原代细胞、Vero细胞、人二倍体细胞三种狂犬病疫苗存在，主流产品是Vero细胞狂犬病疫苗。在Vero细胞狂犬病疫苗生产工艺中，需要对Vero细胞残余DNA进行残余量的控制，以控制最终产品在致瘤方面的潜在风险。以Vero细胞工艺制备狂犬病疫苗，残余DNA的去除方法非常重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种低Vero细胞残留DNA狂犬病疫苗原液的制备方法，以解决现有技术Vero细胞狂犬病疫苗制备工艺中，残余Vero细胞DNA的去除问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种低Vero细胞残留DNA狂犬病疫苗原液的制备方法，具体制备步骤包括：用玻璃纤维滤芯进行过滤；所述玻璃纤维滤芯孔径为0.6～1.0μm。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明在病毒收获后，对病毒液进行玻璃纤维过滤，并通过限定玻璃纤维的特定孔径，使破碎的细胞碎片得到有效截流过滤；同时，之所以要采用玻璃纤维作为滤芯材料，是因为玻璃纤维化学本质为二氧化硅，二氧化硅表面硅烷醇基团与细胞破碎产生的生物质表面基团可形成大量氢键，虽然两者之间形成的氢键作用力较弱，但是数量巨大，可以使细胞破裂产生的DNA等生物质杂质在短时间内牢牢的吸附在二氧化硅表面，实现对收获液进行过滤纯化。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

一种低Vero细胞残留DNA狂犬病疫苗原液的制备方法，具体制备步骤包括：用玻璃纤维滤芯进行过滤；所述玻璃纤维滤芯孔径为0.6～1.0μm。

上述技术方案在病毒收获后，对病毒液进行玻璃纤维过滤，并通过限定玻璃纤维的特定孔径，使破碎的细胞碎片得到有效截流过滤；同时，之所以要采用玻璃纤维作为滤芯材料，是因为玻璃纤维化学本质为二氧化硅，二氧化硅表面硅烷醇基团与细胞破碎产生的生物质表面基团可形成大量氢键，虽然两者之间形成的氢键作用力较弱，但是数量巨大，可以使细胞破裂产生的DNA等生物质杂质在短时间内牢牢的吸附在二氧化硅表面，实现对收获液进行过滤纯化。

所述具体制备步骤包括：用Mustang Q XT140膜层析处理。

Mustang Q膜是一种复合了离子基团的聚醚砜，它能特异性对滤过的液体中的DNA产生吸附作用，进而去除DNA杂质。