[发明专利]一种牛支原体VspX基因突变株及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种牛支原体VspX基因突变株，命名为牛支原体(Mycoplasma bovis)T8.101，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 20191038，所述VspX基因具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。本发明还公开了该突变株的构建方法及其在牛支原体致病机制和免疫防控领域中的应用。该突变株不表达突变基因编码的蛋白，生长曲线、菌落形态和大小与野生菌株无明显差异。但对牛肺上皮细胞系和纤连蛋白的结合能力却显著下降，有作为毒力致弱菌株在牛支原体致病机制研究和防制药物研发领域应用的潜力。

技术领域

本发明属于动物传染病防治技术领域，具体涉及一种牛支原体VspX基因突变株，本发明还涉及该菌株的构建方法及其在牛支原体致病机制和免疫防控领域中的应用。

背景技术

牛支原体(Mycoplasma bovis,M.bovis)是引起牛呼吸道疾病的重要病原之一，导致多种临床病症，主要包括支气管肺炎、乳腺炎、关节炎、生殖道炎和腱鞘炎等。由于其致病机理不清，目前临床上仍然缺乏有效的疫苗，抗生素治疗效果差，疗程长，易产生耐药性，导致本病防控困难，给肉牛和奶牛产业造成巨大经济损失。

尽管支原体是已知基因组中最小的基因组，但缺乏有效的可用于支原体的遗传操作技术，因此，使其基因功能的注释长期落后于其他细菌。原因主要包括：牛支原体编码色氨酸的密码子UGA在异源宿主中被视为终止密码子，因此，无法在外源表达系统中表达全长蛋白；其次，在某些支原体中同源重组效率很低，限制基因定点突变；此外，许多支原体自身缺少可用于基因操作的质粒，必须引入外来质粒。

目前，基于转座子的突变技术是一种对支原体非常有价值的基因工具。Tn4001转座子大小为4.7kb，来源于金黄色葡萄球菌，具有表型易筛选、插入位点多，易操作等功能优势，特别适合支原体基因操作；对其修饰后建立的Tn4001 mod、min-Tn4001和mini-Tn4001-SGM等又增加新的优点，如修饰位点唯一、抗性筛选范围增大或再次转座几率降低等。现在这些转座子已广泛用于多种支原体随机突变体库构建。国内尚未见关于利用min-Tn4001转座子构建牛支原体随机插入突变体库的报道。构建牛支原体饱和转座突变体库可以绘制全基因图谱，快速破译每个基因的功能。

牛支原体VspX基因长度为689bp，编码VspX蛋白，研究表明，该蛋白具有纤溶酶原(PLG)结合特性。因此，本发明将含有mini-Tn4001转座子的pMT85质粒在PEG介导下，将其随机转入到牛支原体中，并从中筛选出VspX基因插入突变株，对其生长特性和黏附性进行初步研究，从而确定该突变株的新特征：与野生株相比，突变株生长速度不受影响，降低与牛肺上皮细胞系(EBL)和纤连蛋白(Fibronectin，Fn)结合特性。Fn为一种细胞外基质成分(ECM)，它可以作为分子桥连接细菌黏附素与宿主细胞的表面受体，因此，具有Fn结合特性的蛋白在细菌的致病中起重要作用，其编码基因为毒力基因，该基因突变株的成功构建为深入研究牛支原体分子致病机理提供很好的遗传操作工具。黏附肺上皮细胞是M.bovis入侵肺组织的关键步骤，黏附力降低提示其毒力可能下降，因此，该突变株也有应用于新型疫苗开发的潜力。

发明内容

本发明的目的在于克服现有的技术障碍，提供一种牛支原体VspX基因突变株及其构建方法和应用，与牛支原体野生菌株相比，该突变株对EBL细胞的黏附能力显著下降，进一步证明其对Fn的结合能力也降低，因而该突变株在牛支原体病致病机理研究和免疫防控领域有潜在的应用前景。

本发明提供的突变株是以M.bovis HB0801(GenBank登录号为CP002058)为亲本菌株，利用聚乙二醇(PEG)介导的转化方法，将含有min-Tn4001转座子的pMT85质粒转化到牛支原体中，再利用庆大霉素做抗性筛选标志，对突变菌株进行初筛、复筛和转座子稳定性检测后，成功构建一种转座子插入突变体，插入在VspX基因中，命名为M.bovis T8.101，已于2019年12月11日保藏于湖北省武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏编号为CCTCC NO:M 20191038。