[发明专利]一种镜面辅助三维超分辨显微成像系统及方法

说明书

本发明公开了一种镜面辅助三维超分辨显微成像系统及方法。该系统包括两组激光器、二分之一波片、偏振分光棱镜、三个光学反射镜、两个空间光调制器、二向色镜、四分之一波片、显微物镜和介质膜反射镜。该方法包括：仅对一路损耗光进行相位调制，同时对激发光进行相位调制，经四分之一波片转换为圆偏振光，再经显微物镜投射到介质膜反射镜上并被反射，对应的反射光和投射光发生干涉分别形成三维空心光斑和实心焦斑，三维空心光斑覆盖到实心焦斑上，有效地压缩了实心光斑的轴向和横向尺寸，提高了显微系统的空间分辨率，从而实现三维超分辨显微成像；通过改变调制相位的模式，可以调整光束所成光斑的位置，实现生物样品的全细胞成像。

技术领域

本发明涉及光学显微成像领域，特别用于荧光显微镜实现三维超分辨显微成像。

背景技术

光学显微镜的分辨率因衍射极限的存在而无法突破半波长量级，为了观察更加精细的微观结构，科学家们研究了多种提高光学显微系统分辨率的方法以实现超分辨成像。在这一系列的超分辨显微方法中，受激辐射淬灭显微术(STED：Stimulated EmissionDepletion Microscopy)因其高分辨率且高信噪比而成为国内外研究者们关注的焦点。

受激辐射淬灭显微术先是生成一个“甜甜圈”状的空心淬灭光斑，然后将其覆盖在激发光产生的实心焦斑上，这使焦斑外圈的荧光分子以受激辐射的方式瞬间回到基态而不再发光，焦斑中心的荧光分子未被淬灭而正常发光，从而得到超衍射极限的分辨率。虽然受激辐射淬灭显微镜打破了光学衍射极限，但是其轴向分辨率仍然远差于横向分辨率，为了得到较小的三维空心淬灭光斑，科研工作者们提出了许多方法。其中，S.W.Hell课题组通过搭建两个正对的物镜，使得两边的激发光和损耗光各自相干涉，构成4π系统将轴向分辨率提高了3～7倍。但是，由于两个物镜的对称结构极其不稳定且系统搭建难度大，这种方法的应用受到了限制。该课题组之后又借助0～2π涡旋位相板和0/π位相板的组合使用来生成三维空心淬灭光斑。在这种方法中，损耗光被分成两路，一路经0～2π涡旋位相板的调制用于淬灭横向上的荧光分子，而另一路经0/π位相板的调制用于淬灭轴向上的荧光分子，从而使横向分辨率与轴向分辨率同时提高以实现三维超分辨显微成像。当选用数值孔径为1.4的显微物镜时，采用这种方法所形成的三维空心光斑的横向尺寸约为0.64个波长，而轴向尺寸则为1.5个波长，可见这种方法虽然在结构上比4π成像系统简单，但分辨率并未得到较好的提高。

为了使用结构简单的系统实现较高的分辨率，国内外科研人员都进行了不少研究。其中，席鹏课题组用一块反射镜取代载玻片，将样品放置在反射镜上，通过激发光与其反射光相干涉构成一个虚拟的4π成像系统，使得轴向分辨率达到110nm。相比于双物镜的4π成像系统，这种方法只用了一个物镜，系统结构得到简化，但是分辨率并没有得到进一步提升，而且，轴向上可观测的深度只有离镜面约100nm，无法实现生物样品的全细胞显微成像。现有公开号为CN 102540476 A的专利文献公开了一种三维空心光斑生成方法，对两束损耗光进行不同的相位调制，经显微物镜投射后透过样品面并被介质膜反射镜反射，分别形成横向和轴向空心光斑，两者光强叠加形成三维空心光斑。该方法也是利用较为简单的镜面反射系统将横向分辨率提高为0.56个波长，轴向分辨率提高为0.44个波长。然而，由于实验上两束损耗光要完全合束相对较为困难，实际空间分辨率并未得到进一步提高，且需要两个相位调制器和若干光线折转组件，亦增大了系统复杂度。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种镜面辅助三维超分辨显微成像系统及方法，本发明用一块反射镜取代载玻片，将样品放置在反射镜上，通过投射光与其反射光相干涉构成一个虚拟的4π成像系统，接着将损耗光、激发光分别进行相位调制，以达到空间分辨率的进一步提高和轴向可观测范围的扩展，实现生物样品的三维全细胞超分辨成像。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：