[发明专利]用于稳态速效检测新型冠状病毒的保护序列、引物、探针、组合物、试剂盒及应用和方法

说明书

一种用于稳态速效检测新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的保护序列、引物、探针、组合物、试剂盒及应用和方法，过样本的有效处理释放出靶向基因，自主开发的新型裂解液/保护液能特异有效识别多个2019‑nCoV靶点基因位点并形成复合物试剂，稳定2019‑nCoV病毒RNA。本发明通过对病人样本采用裂解/保护液的有效处理，释放出2019‑nCoV病毒靶向基因，在裂解/保护液中多个靶点基因位点被有效识别形成复合物，使2019‑nCoV RNA更为稳定而无需提取纯化RNA，将富集后的2019‑nCoV RNA复合物一步逆转录为cDNA，产物在自行设计的2019‑nCoV特异性探针识别后经过40cycles信号被放大3.5×1012倍。

技术领域

本发明涉及体外核酸检测技术领域，具体涉及一种用于稳态速效检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的保护序列、引物、探针、组合物、试剂盒及应用和方法。

背景技术

目前，欧洲和美国的新冠疫情还十分严峻，威胁着全人类健康和生命安全。据世界卫生组织公布数据，全球新型冠状病毒性肺炎COVID-19感染累计（截至4/27/2020）确诊超3百万人和死亡病例近19万例。但当前的临床诊断COVID-19核酸检测试剂盒由于较低的敏感性显示出较高的假阴性率和低敏感性（阳性检出率仅为30％-50％），导致临床高度疑似COVID-19感染患者或低病毒潜伏的“假痊愈患者”检测“假阴性”现象频发。高灵敏度和准确性的COVID-19检测试剂研发是疫情防控的重中之重，并非常紧迫。

时至今日，中国国家疾控中心采用“变温扩增技术”的检测试剂盒作为2019-nCoV的确诊标准，国家药监局已经审批15家2019-nCoV核酸检测产品生产机构：华大基因（试剂盒）、华大智造（测序仪）、上海之江生物、国药中国生物上海捷诺、达安基因、圣湘生物、伯杰医疗等。但这些企业很多企业采用国家疾控中心公布的一组2019-nCoV病毒的引物和探针，这组探针引物存在二聚体和发夹结构，可能会影响试剂盒的检出效率。基于我们前期开发针对癌症受检者脱落细胞RNA的检测试剂盒的发明专利技术，自主开发出一种稳态速效检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的核酸检测试剂盒。

2、2019-nCoV主要的诊断方法及其原理

2019-nCoV一般可以通过两种方法检测：

2.1.早期蛋白检测（胶体金试纸）：胶体金试纸是氯金酸的水溶胶，氯金酸在还原剂的作用下，聚合成特定大小的金颗粒，这粒子可以吸附新型冠状病毒的蛋白质而实现检测。胶体金试纸检测方法简略步骤为：室温的样本直接滴加在胶体金试纸上，10-30min，观察试纸出现阳性条带。胶体金试纸对于样本类型及样本底物的浓度要求较高，灵敏度和特异都不强，可用于早期大规模筛查，但不能作为临床检验的确诊手段。

2.2. 后期（恒温或变温两种扩增方法）核酸检测：目前核酸检测中主要采用“变温扩增技术”的检测试剂盒作为2019-nCoV的确诊标准。国家药监局审批7款试剂盒中，华大开发一款基于华大智造的 DNBSEQ-T7测序仪的采用联合探针锚定聚合测序法的试剂盒的），而其他试剂盒均采用荧光PCR法。核酸检测2019新型冠状病毒试剂盒包含两个步骤：①病毒核酸提取。采集病人的体液样本（如咽拭子或鼻拭子）后，首先进行病毒RNA提取。②核酸扩增检测。将提取的病毒RNA进行实时定量PCR扩增检测，由PCR仪器检测到的“荧光信号曲线”，检验医生就能判断该样本是否存在“新型冠状病毒”的感染。

3、目前的2019-nCoV试剂盒均有众多不如人意处：

目前国家批准生产的2019-nCoV核酸检测试剂盒质量参差不齐，核酸检测稳定可靠性（灵敏度和特异性）尚存疑。集中反映在两方面：