[发明专利]尖孢镰刀菌的RT-QPCR检测的引物、探针、试剂盒及方法

说明书

本发明公开了尖孢镰刀菌的RT‑QPCR检测的引物、探针、试剂盒及方法，属于生物技术领域。上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；试剂盒包括上述引物及探针。荧光定量PCR检测方法包括：提取待测样品总DNA；制备反应体系；将模板梯度稀释制成标准曲线样品及阳性对照样品；将待测样品、标准曲线样品、阳性对照样品、阴性对照样品使用引物和探针进行荧光定量PCR扩增；绘制标准曲线，计算结果。本发明的引物、探针及试剂盒，具有高度特异性和良好的灵敏度，能快速、准确度地尖孢镰刀菌进行检测。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及尖孢镰刀菌的实时荧光定量PCR检测的引物、探针、试剂盒及方法。

背景技术

尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)可侵染多种植物引起维管束萎蔫病害，对农业生产造成严重威胁。是植物根腐病的主要致病菌，能对三七、天麻、太子参、棉花等产生危害。尖孢镰刀菌能侵入植物根部引起根腐或侵入植物维管束系统导致植物萎蔫枯死，并在植物全生长过程中均可发生，其他菌株虽能侵入根部但不能侵入植物维管束系统引起病害。该病会造成根部腐烂，导致植物吸收水分和养分的功能逐渐减弱，最后全株死亡，主要表现为整株叶片发黄、枯萎。尖孢镰刀菌具有易变异以及多型性的特点，种内生力分化十分明显，在种下又可分为多个专化性和生理小种，因此镰刀菌的遗传多样性一直是研究的热点。多年来，人们都是依据形态学特征、致病性及营养体融合群等试验来研究该菌的的多态性，而这些方法既费时又费力又不能准确地揭示物种的进化关系。

现有技术中，采用多重PCR检测尖孢镰刀菌虽然特异性好、准确性高，然而其PCR结果需要通过琼脂糖电泳进行分析，影响因素较多。随着分子生物学技术的不断发展，RT-QPCR(实时荧光定量PCR)目前已广泛应用于菌种的检测。其与常规的分离培养方法相比，具有耗时短、操作简便、特异性好的特点，且结果可直接观察，能有效避免操作过程中引起的污染。但尖孢镰刀菌与其它镰刀属菌种有着较高的同源性，如腐皮镰刀菌、三线镰刀菌、禾谷镰刀菌。因此提供一种用于尖孢镰刀菌的PCR检测方法，具有高度特异性，准确度高，成为了本领域技术人员亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的之一在于，提供一种尖孢镰刀菌的RT-QPCR检测的引物，特异性好，准确度高。

本发明的目的之二在于，提供一种尖孢镰刀菌的RT-QPCR检测的探针。

本发明的目的之三在于，提供一种尖孢镰刀菌的RT-QPCR检测的试剂盒。

本发明的目的之四在于，提供一种尖孢镰刀菌的RT-QPCR检测的方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明通过对NCBI数据库中尖孢镰刀菌18SrRNA基因全序列进行生物信息学比对分析，选取适合设计引物和探针的保守片段序列为靶目标，并进一步应用Primer express3软件、Primer Premier 5软件以及Oligo 7软件，设计了多组实时荧光定量PCR引物与探针，经过试验初步筛选，最终确定了一组用于检测尖孢镰刀菌的荧光定量PCR引物和探针。

本发明所述的尖孢镰刀菌的RT-QPCR检测的引物，所述引物包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，

上游引物：5'-ATGTGCGTTCAAAGATTCGAT-3'；

下游引物：5'-AGAGGACCCCTAAACTCTG-3'。

本发明所述的尖孢镰刀菌的RT-QPCR检测的探针，该探针的核苷酸序列如 SEQ IDNO:3所示：5'-ATCGATGAAGAACGCAGCAA-3'；优选地，所述探针5’端标记的荧光报告基团为VIC，3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ。