[发明专利]腐皮镰刀菌的RT-QPCR检测的引物、探针、试剂盒及方法

说明书

本发明公开了腐皮镰刀菌的RT‑QPCR检测的引物、探针、试剂盒及方法，属于生物技术领域。上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；试剂盒包括上述引物及探针。荧光定量PCR检测方法包括：提取待测样品总DNA；制备反应体系；将模板梯度稀释制成标准曲线样品及阳性对照样品；将待测样品、标准曲线样品、阳性对照样品、阴性对照样品使用引物和探针进行荧光定量PCR扩增；绘制标准曲线，计算结果。本发明的引物、探针及试剂盒，具有高度特异性和良好的灵敏度，能快速、准确度地腐皮镰刀菌进行检测。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及腐皮镰刀菌的实时荧光定量PCR检测的引物、探针、试剂盒及方法。

背景技术

腐皮镰刀菌(Fusarium solani)是植物根腐病的主要致病菌，主要对黄芪、丹参、甘草、板蓝根等产生危害。根腐病是一种真菌引起的植物病，该病会造成根部腐烂，导致植物吸收水分和养分的功能逐渐减弱，最后全株死亡，主要表现为整株叶片发黄、枯萎。腐皮镰刀菌根据其形状、厚垣孢子和长管瓶的存在确定其为大分生孢子，然而形态学鉴定不能区分不同的生物物种和具有共同形态特征而基因多样的有丝分裂菌株，如若采用传统的鉴定方法，容易出现偏差，且耗时较长。

现有技术中，多重PCR检测腐皮镰刀菌虽然特异性好、准确性高，然而其 PCR结果需要通过琼脂糖电泳进行分析，影响因素较多。。随着分子生物学技术的不断发展，RT-QPCR(实时荧光定量PCR)已广泛应用于菌种的检测。其与常规的分离培养方法相比，具有耗时短、操作简便、特异性好的特点，且结果可直接观察，能有效避免操作过程中引起的污染。但腐皮镰刀菌与其它镰刀属菌种有着较高的同源性，如燕麦镰刀菌、三线镰刀菌、禾谷镰刀菌。因此提供一种用于腐皮镰刀菌的PCR检测方法，具有高度特异性，准确度高，成为了本领域技术人员亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的之一在于，提供一种腐皮镰刀菌的RT-QPCR检测的引物，特异性好，准确度高。

本发明的目的之二在于，提供一种腐皮镰刀菌的RT-QPCR检测的探针。

本发明的目的之三在于，提供一种腐皮镰刀菌的RT-QPCR检测的试剂盒。

本发明的目的之四在于，提供一种腐皮镰刀菌的RT-QPCR检测的方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明通过对NCBI数据库中腐皮镰刀菌ITS基因全序列进行生物信息学比对分析，选取适合设计引物和探针的保守片段序列为靶目标，并进一步应用 Primer express 3软件、Primer Premier 5软件以及Oligo 7软件，设计了多组实时荧光定量PCR引物与探针，经过试验初步筛选，最终确定了一组用于检测腐皮镰刀菌的荧光定量PCR引物和探针。

本发明所述的腐皮镰刀菌的RT-QPCR检测的引物，所述引物包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，

上游引物：5'-AGAGGACCCCTAACTCTGT-3'；

下游引物：5'-ATGTGCGTTCAAAGATTCGAT-3'。

本发明所述的腐皮镰刀菌的RT-QPCR检测的探针，该探针的核苷酸序列如 SEQ IDNO:3所示：5'-TCTCTTGGCTCTGGCATCG-3'；优选地，所述探针5’端标记的荧光报告基团为FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ。

ITS基因广泛存在于腐皮镰刀菌中，具有很高的保守性。本发明采用腐皮镰刀菌ITS基因作为靶序列，合成了引物及探针。

本发明所述的腐皮镰刀菌的实时荧光定量PCR检测的引物及探针组合，包括：