[发明专利]高效液相色谱法测定L-缬氨酸原料中其他氨基酸的方法

说明书

本发明提供一种用高效液相色谱法测定L‑缬氨酸原料中其他氨基酸的方法，配制L‑正缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸对照品溶液；经高效液相色谱仪检测，供试品色谱图与对照品溶液色谱图中L‑正缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸的出峰时间及峰形进行对比，判定供试品溶液中是否含有其他氨基酸。本方法通过筛选氨丙基键合硅胶色谱柱，找到分离效果，筛选波长，找到各氨基酸的最大吸收，并利用乙腈/磷酸盐缓冲液二元流动相，通过调节三乙胺比例、pH值及两相比例来调控各氨基酸峰在色谱柱上的保留时间，有效防止氨基柱中键合氨丙基的水解脱落，解决氨基柱反相使用寿命不长，基线不稳的问题。

技术领域

本发明涉及一种测定L-缬氨酸原料中其他氨基酸的方法，具体为采用高效液相色谱法检测L-缬氨酸原料中L-正缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸的残留的方法。

技术背景

L-缬氨酸(L-2-氨基-3-甲基丁酸；CAS号：72-18-4)属人体必需氨基酸，作为氨基酸类药，营养增补剂，可作氨基酸输液、综合氨基酸制剂的主要成分。其具有分子式C₁₀H₂₀N₂O₄，且具有下述结构式：

L-缬氨酸是三个支链氨基酸之一，属必需氨基酸，可治疗肝功能衰竭、中枢神经系统功能紊乱，其作为氨基酸输液、综合氨基酸制剂的主要成分，具有广泛的市场前景。针对发酵法生产缬氨酸均为L-型，无需旋光拆分，但在成品中会存在一些其他氨基酸，给其临床应用带来一些影响。同时由于L-缬氨酸其他氨基酸检测，在中国药典2015年版和美国药典42版均采用薄层色谱法，其检测灵敏度差，各类氨基酸不明确，无法明确显示各类其他氨基酸的具体含量。采用美国药典40版的磷酸盐和乙腈二元流动相体系，氨基柱使用寿命不长，基线不稳，且L-缬氨酸与本发明提到的其他氨基酸无法基线分离。采用氨基酸分析仪，设备成本和检测成本昂贵，不宜普及。本发明针对现有技术不足，经过长期实践研究，确定一种灵敏度高，检测时间短的其他氨基酸检测方法，其能够快速灵敏的检测出L-正缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸的含量，并且能够使L-缬氨酸与其他氨基酸基线分离。

发明内容

本发明的技术方案利用高效液相色谱法测定L-缬氨酸原料中其他氨基酸含量的检测方法。本方法通过筛选不同品牌的氨丙基键合硅胶色谱柱，找到分离效果，基线效果最好的色谱柱，筛选波长，找到各氨基酸的最大吸收，并利用乙腈/磷酸盐缓冲液二元流动相，通过调节三乙胺比例、pH值及两相比例，选择合适三乙胺的量、pH及两相比例来调控各氨基酸峰在色谱柱上的保留时间，提高峰的分离度和理论塔板数，改善色谱峰形，空白溶剂不干扰各氨基酸的检测，并有效防止氨基柱中键合氨丙基的水解脱落，解决氨基柱反相使用寿命不长，基线不稳的问题。

本发明实施例采用了如下技术方案：

一种用高效液相色谱法测定L-缬氨酸原料中其他氨基酸的方法，在以下色谱条件下进行高效液相色谱分析：

色谱柱：氨丙基键合硅胶色谱柱；

流动相：体积比为70～76：24～30的乙腈与磷酸盐缓冲液的混合溶液，其中磷酸盐缓冲液浓度为10～20mmol/L，加入0.1％-0.3％的三乙胺，用磷酸调节pH为6.0～6.5；

流速：0.8～1.2ml/min；

柱温：20～30℃；

进样体积：20μl；

检测波长：UV210nm。