[发明专利]细胞色素P450酶人源化大鼠模型及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种用于药物代谢研究的CYP酶人源化大鼠动物模型的构建方法及其应用。所述构建方法包括基因型鉴定，人源基因表达鉴定，人源基因功能验证。本发明首先利用CRISPR系统进行CYP酶人源化大鼠的构建，包括基因编辑靶点的选择、sgRNA与Cas9mRNA的体外合成与转录、同源重组模板构建、假孕母鼠的制备、单细胞胚胎的体外显微注射与移植、大鼠的繁殖，最后得到纯合子CYP基因人源化大鼠。然后对纯合子人源化大鼠从蛋白水平进行CYP酶表达检测，以及进行其代谢功能验证，以证明该CYP人源化大鼠构建成功。本发明构建的CYP1A2人源化大鼠具有和人更相似的代谢特征，消除了大鼠与人之间CYP1A2介导药物代谢的种属差异，为CYP介导的药物代谢研究提供了新的大鼠动物模型。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及细胞色素P450酶人源化大鼠及其构建方法和应用。

背景技术

一种新药的上市通常经过漫长的过程，一般分为研究阶段和开发阶段，主要包括靶标确立，化合物活性筛选，先导化合物的优化，临床前研究及临床研究等过程。有统计显示临床研究中40％的药物因其药动学性质不佳而被迫中止研究。因此在早期化合物筛选阶段就对化合物代谢及药代动力学性质进行评估有利于减小后期研究的投入和失败的风险，其中基于细胞色素P450酶(CYP酶)的药物筛选及其相关的代谢研究在新药研发中占有重要地位。

细胞色素P450酶是一类含血红素的细胞色素超家族蛋白酶。因其还原性状态与一氧化碳复合物在450nm处有最大吸收而得名，是至今为止发现的最重要的药物代谢酶超家族，其中涉及药物代谢的主要为CYP1，CYP2，CYP3三个亚家族。CYP酶不仅代谢大部分的药物以及外来有害物质，致癌物等，也是参与体内胆固醇及固醇类激素代谢的重要酶类，在维持人体健康方面起着重要作用。因此CYP酶在药物代谢和药代动力学研究中占有重要地位。

由于伦理学的原因，大量新药的药效学与药物代谢情况都无法在人体上直接观察，而是借助于实验动物得到的数据推算人体的情况。大鼠作为药物代谢及药代动力学研究中应用广泛的啮齿类模式动物，相对于小鼠具有很大的优势，如体型大容易操作，血量多耐受性强，可得样本量多等。但是大鼠和人之间的CYP酶具有一定种属差异，使得大鼠上的研究结果难以直接类推到人。近年来，为了克服CYP酶在亚型组成、蛋白表达、催化活性以及底物特异性上的种属差异，建立一个能更好地评估药物代谢特征的模型，科学家在构建人源化动物模型上做出了很多努力。但是目前世界上并没有成熟的CYP人源化大鼠模型构建方法，CYP人源化大鼠动物模型也未见广泛应用。

CRISPR全称为Cluster Regularly Interspaced Short Palindromic RepeatsRNA，即规律成簇间隔短回文重复RNA，是最近几年才发现的原核生物的调控RNA，包括多个短的重复序列，而Cas的全称为CRISPR-associated system，即CRISPR相关系统。CRISPR/Cas系统是目前发现存在于大多数细菌与所有古生菌中的一种后天免疫系统，通过小片段RNA的介导对外源核酸分子进行切割，降解，以消灭外来的质体或噬菌体。由于其对脱氧核苷酸的干扰特性，被用作基因剪辑工具。经过Cas9蛋白的切割，目的基因会形成DNA分子的双链断裂(Double-strand breaks，DBS)，DBS一旦形成，真核细胞会启动修复程序，根据供体模板的不同，主要有易错非同源末端接合(error-prone non-homologous end joining,NHEJ)或高保真同源重组(high-fidelity homologous recombination)两种修复途径。当人为提供同源重组模板时，DSB的修复可能以外源提供的同源质粒为模板进行修复，从而将外源基因整合进其基因组。CRISPR/Cas9系统介导的人源化，不仅能避开胚胎干细胞培养的瓶颈，而且能提高靶向效率，降低模型构建成本，提升动物模型构建的成功率。

发明内容