[发明专利]甲型流感通用型DNA疫苗及其制备方法和应用

说明书

本发明提供一种甲型流感通用型DNA疫苗及其制备方法和应用，本研究利用由流感病毒HA蛋白、M2e蛋白和NP蛋白高度保守性序列构建三种融合蛋白的基因，并将其克隆至pCDNA3.1(+)载体，构建出三种重组DNA疫苗pcDNA3.1‑sHA，pcDNA3.1‑mHA，pcDNA3.1‑cHA。该DNA疫苗能用于预防哺乳类野生动物，如虎流感同源病毒和异源病毒等方面；本发明DNA疫苗的制备方法简单、成本低，免疫原性好、交叉保护性好，能满足大批量流感疫苗的制备需求，生物安全性、能激发机体对多种流感病毒的免疫。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，微生物领域及生物制药领域，特别涉及甲型流感通用型DNA疫苗及其制备方法和应用。

背景技术

流感病毒能引起人和动物的感染，流感大流行是给人类健康和社会经济带来大损失的灾难。它具有潜伏期短，发病急剧，传播速度快，并发症多等特点。在过去的一百年里，发生了四次的流感疫情大流行，有数亿人曾感染和数千万人因此丧命。自从1918年西班牙流感大流行后，英国科学家于1933年分离出第一株H1N1流感病毒株，这大大加快了人类对流感病毒的认识，在1940s首次出现了流感疫苗，这使人类防控流感病毒大流行成为了可能。

流感病毒根据内部核蛋白(NP)和外部基质蛋白(M)的抗原性差异，可将其分为甲(A)，乙(B)，丙(C)三种类型，其中甲型流感病毒根据血凝素(HA)，神经氨酸酶(NA)进一步分型，其中HA分为17种亚型，NA分为9种亚型，能互相组合成153个血清型甲型流感病毒。接种疫苗是防控流感流行的最佳手段。现有的疫苗能对同亚型的流感病毒感染起到良好的预防效果，但对不同亚型的流感病毒感染几乎无效。流感病毒具有高度变异性，想要有效防止流感大爆发，需要每年都更新流感疫苗候选株，世界卫生组织(WHO)会根据大数据分析去预测下一年的流感疫苗候选株，一般会预测3-4个候选株，其中包括一个H1N1亚型，一个H3N2亚型，B型流感的1或2个谱系，以此制备出三价或四价的流感灭活疫苗。能否预测成功会直接影响当季疫苗的保护效率。从确定候选株到商品化疫苗上市需要时间较长，如果预测失败，将会直接导致当季的流感大流行，无法快速重新制备出有效的流感疫苗。因此，研制出一种高效的具有广谱保护活性的通用型流感疫苗对于预防流感流行具有重要意义。

目前上市的疫苗结合其他防控措施在控制扩散和清除流感疫情方面有着良好的临床表现，疫苗接种仍是防控流感的保守措施之一。但仍存在负面影响和潜在威胁。为解决这些问题，新型的流感疫苗的应用有待继续深入探索和研发。

发明内容

为在现有技术的基础上更进一步，本发明的目的在于解决现有流感疫苗产生的免疫保护力为短效窄谱，提供一种由3种融合蛋白和真核表达载体组成的甲型流感通用型DNA疫苗。该疫苗可以对多季多亚型甲型流感疫苗提供保护，减少感染，对流感防控具有十分重要的意义。

本发明提供了一种甲型流感通用型DNA疫苗，所述疫苗包括血凝素融合蛋白过表达质粒。

进一步，所述血凝素基因来自H5N1流感病毒。

在本发明中用作对照的HA基因序列如SEQ ID NO.4所示。

进一步，本发明的一种融合蛋白为sHA，其包括HA，M2e，NP的全部或部分抗原表位。优选地，sHA还包括HA蛋白的蜂毒信号肽和跨细胞膜区片段。

更进一步，sHA从N端到C端的序列构成为：蜂毒信号肽+NP的两段保守序列+5×M2e(来自不同亚型，不同种属)+HA2，序列间用连接肽连接。

在本发明的具体实施方案中，所述融合蛋白sHA的编码基因序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步，本发明的一种融合蛋白为mHA，其包括HA的全部或部分抗原表位。优选地，mHA还包括HA蛋白的蜂毒信号肽和跨细胞膜区片段。