[发明专利]一种环状RNA circRalgapa1及其应用

说明书

本发明公开了一种环状RNA circRalgapa1及其应用。该环状RNA circRalgapa1是首次报道的全新环状非编码RNA，并被证实与吗啡耐受相关。该药物减缓了吗啡耐受的形成，为治疗慢性疼痛及吗啡耐受提供新的途径。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域。本发明涉及一种内源性的非编码环状RNA及其新药用途，具体涉及circRalgapa1及其在制备用于缓解或治疗慢性疼痛、吗啡耐受药物中的应用。

背景技术

疼痛是我们身体的保护性机制，但它在给我们保护的同时，带来了一定困扰，尤其是慢性痛。而吗啡常用来治疗急性疼痛和癌痛，目前在临床上仍然是被广泛使用的镇痛药物之一。但是，它除了镇痛之外，还有很多副作用，其中较为头疼便是其耐受性。也因为其耐受性的产生，严重阻碍了吗啡治疗慢性疼痛的效能。吗啡耐受是指反复暴露于吗啡导致药物的治疗效果降低或需要较高剂量以维持相同效果的现象，这在剂量-反应曲线中表现为向右移位。吗啡耐受形成的机制仍然不清楚，目前相关的研究大部分处于分子学水平，而近几年新出现的证据表明，表观遗传机制介导的基因表达调控功能失调在多种原因引起的慢性疼痛的发生和维持中发挥着关键作用，所以我们对吗啡耐受的研究也逐渐转向表观遗传学方向。

circRNAs(环状RNAs)是近年来新出现的一种非编码RNA，它可以由外显子或者是内含子产生，它们不同于其他RNA，具有独立的形成方式，并且circRNAs在调控基因表达方面的潜在功能也正逐渐被大家熟知。全基因组的研究表明circRNAs是多种多样的、丰富的，而且往往在进化上是保守的。同时circRNAs具有高度同源性，并且通常比线性RNA更稳定，因为它们缺乏poly A尾，因此对外切酶(Rnase R)具有抵抗性。随着生物技术的进步，特别是生物信息学和高通量测序技术的发展已经让研究者发现和鉴定了大量circRNAs。随着对它们认识的深入，我们对其功能的了解也更广，但对吗啡耐受这一课题而言，目前还未出现更为详尽的circRNAs调节吗啡耐受机制的研究。

发明内容

本发明的首要目的是提供一种新的内源性的环状RNA circRalgapa1(chr6：76491315-76492176)，其cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。该环状RNA circRalgapa1是首次报道的全新环状非编码RNA，并被证实与吗啡耐受相关，该环状RNA来源于小鼠。

本发明的第二个目的是提供所述的circRalgapa1在制备治疗或者缓解慢性疼痛的药物中的应用。所述药物减缓了吗啡耐受的形成。

进一步的，所述的治疗或者缓解慢性疼痛的药物是指抑制吗啡耐受的药物。

进一步的，所述的抑制吗啡耐受的药物是指过表达circRalgapa1的制剂。

进一步的，所述的过表达circRalgapa1的制剂为circRalgapa1过表达慢病毒载体。

进一步的，circRalgapa1过表达慢病毒载体的构建方法如下：

(1)用全长引物进行PCR扩增circRalgapa1序列后，将目的片段与空白载体双酶切后连接形成重组质粒并转入感受态细胞DH5α；转化后的细胞涂于含氨苄青霉素的细菌培养板上，培养过夜；平板挑菌后，摇菌；用菌液进行PCR鉴定后，并将阳性克隆菌液进行Sanger测序；测序结果正确的重组质粒，用无内毒素质粒大提试剂盒抽提质粒；

(2)293T细胞做转染前准备，加入含慢病毒质粒以及各种辅助质粒进行转染；转染后离心去除细胞碎片，收集病毒上清液，过滤，超速离心，最后得到慢病毒超离液。

进一步的，扩增circRalgapa1全长线性序列引物为F1：5'TGAAAACTCAGATGCAACAAGGATT 3’，见SEQ ID NO.2；

R1：5'CGTTTGTCCCAGGAATTCATTCC 3’，见SEQ ID NO.3。