[发明专利]一种人用狂犬病疫苗中宿主DNA去除方法

说明书

本发明公开了一种人用狂犬病疫苗中宿主DNA去除方法，包括将病毒收获液超滤浓缩，得浓缩液；将浓缩液进行病毒灭活，得灭活浓缩液；将灭活浓缩液纯化，得原液；将原液配制、除菌后，分装、冻干，即得疫苗成品；以及，对病毒收获液进行高压均质处理，或对灭活浓缩液进行高压均质处理，或对纯化后原液进行高压均质处理。本发明采用的处理工艺可有效去除疫苗中宿主DNA，起到良好的纯化效果，且处理方式简单，成本较低，具有广阔的商业化前景。

技术领域

本发明涉及人用疫苗纯化技术领域，具体是一种人用狂犬病疫苗中宿主DNA去除方法。

背景技术

狂犬病是由狂犬病病毒引起的一种人兽共患传染病，是世界上病死率最高的疾病。一般被携带病毒的动物咬伤后感染，一旦发病，死亡率为100％。据估计每年造成59000人死亡，主要发生在卫生服务水平低下的农村和城市，区域以亚洲、非洲和拉丁美洲为主，不同种族的人群对狂犬病均有普遍易感性，大多数病例发生在非洲和亚洲，约有40％是15岁以下儿童。我国仅次于印度，为世界第二发病率高的国家。

近年来我国狂犬病发病人数不断走低，表明狂犬病防治和狂犬疫苗接种对控制狂犬病流行具有决定性意义。在条件许可的情况下对人群的普遍性预防性接种，可望避免由狂犬病引其的人员死亡。

在狂犬疫苗生产中，经病毒感染的细胞培养上清液中含有目标物狂犬病毒，而且还有宿主细胞碎片和蛋白以及宿主DNA，以及细胞培养基组份。这些杂质都是需要去除的。其中，以传代细胞制备人用狂犬疫苗安全性的关键是细胞残余DNA的含量。中国药典规定人用狂犬疫苗(Vero)细胞)的宿主DNA残留量不得高于3ng/剂(PCR法)。

传统的狂犬病毒纯化路线主要采用超滤浓缩和凝胶过滤色谱法。其中，凝胶过滤色谱法是目前最有效的纯化方法，但是该方法的纯化效果并不能满足人用狂犬疫苗制品新的国家标准3ng/剂(PCR法)的要求，主要原因是凝胶过滤色谱法是根据生物分子量大小进行分离的，而病毒与宿主DNA的分子量不相上下，不能在凝胶介质中被有效分离。

此外，采用在病毒收获液中添加硫酸鱼精蛋白的方法去除 DNA，原理是硫酸鱼精蛋白可以与DNA结合，结合物容易沉淀，使用离心的方法能有效去除DNA。但是同时鱼精蛋白也与病毒结合，病毒损失严重，通常回收率只有25～30％。

此外，在超滤浓缩后加入核酸酶处理步骤，经过酶切以后的DNA变成了小片段，然后再经过凝胶过滤色谱步骤，使大部分DNA和病毒分离开。但是由于核酸酶的作用受环境条件限制，不能完全发挥效果，仍有极小一部分DNA不能和病毒分开，最终DNA残留量还停留在纳克(ng)级水平。结果只是接近国家标准，仍然很难达到合格水平。

近几年，在狂犬病毒的纯化过程中引入了离子交换色谱步骤，首先是阴离子交换色谱，让DNA和病毒一起被吸附在介质上，然后控制条件仅对病毒洗脱，能够使成品中DNA的残留量降低至1ng/剂，但是病毒量的回收率只有大约20％。

CN102282253A公开了一种狂犬病病毒纯化方法，使用一步阳离子交换色谱法能够使DNA的去除率达到95％以上，而病毒回收率在70％以上。所述的阳离子交换介质是MERK公司的产品 Fractogel EMD S03_，结合后续的核酸酶处理步骤和超速离心纯化步骤，最终得到的病毒液配制成的狂犬疫苗，在含有2.5IU 有效剂量里DNA残留量小于1ng。整个纯化过程病毒回收率在 50％左右。然而，CN102282253A公开的狂犬病病毒纯化工艺过于复杂，生产成本高。

CN102282253A公开了采用离子交换色谱纯化狂犬病病毒的工艺，先将被病毒感染的细胞的培养物的上清液与阳离子交换色谱胶体接触，以便让狂犬病毒结合在胶体上，随后从胶体上洗脱该病毒。这样的工艺流程主要是为了去除病毒液中的宿主DNA残留，但是由于病毒先吸附再洗脱的做法使得病毒量损失较大。而且病毒和宿主DNA都吸附在胶体上，先后洗脱病毒和DNA的做法也导致了DNA去除不彻底的后果。