[发明专利]一种新的提取鱼软骨中硫酸软骨素的方法

权利要求书

1.一种新的提取鱼软骨中硫酸软骨素的方法，其特征在于，该种新的提取鱼软骨中硫酸软骨素的方法具体包括以下步骤：

步骤一：材料预处理，选择鱼软骨脱脂后，然后利用粉碎机将其粉碎，接着加入6%至9%的氢NaOH溶液和氯化钠溶液在温度为61℃至75℃的条件下提取2小时至4小时30分钟，过滤后调滤液pH=8-9；

步骤二：微生物筛选并发酵培养，用无菌水将土样悬浮制成11%至20%的土壤溶液，利用多层滤纸抽滤后使液体澄清，然后将液体梯度稀释至11至15，取稀释液0.5ml涂布分离培养基平板培养，接着将单菌落用平板划线分离方法在分离培养基平板上纯化3次，挑取纯化后的单菌落点种于初筛培养基平板，33℃至35℃温箱中培养三天至五天后，向平板中倒入8ml4mol/L的冰醋酸，浸泡2min，将产生透明圈的菌株利用划线法保存于试管固体斜面培养基上并于5℃保存待用,将产生透明圈的菌体接种于复筛培养基中，利用恒温器控制温度保持在33℃，145r/min振荡通气培养1天，将菌液梯度稀释至11至15，取0.5ml11至15的菌液，涂布于初筛培养基中，33℃至35℃温箱中培养三天至五天后，通过测量挑选透明圈相对于菌落较大的菌株，接种于复筛培养基中，利用恒温器控制温度保持在33℃、145r/min振荡通气培养两天，经平板菌落计数得菌体密度为2×108-3×108个/ml作为种子菌液，肉眼观察菌落的形态特征，按3%至5%v/v接种量将种子菌液接入发酵罐中通过发酵培养基发酵，33℃至35℃，发酵36小时至48小时；

步骤三：硫酸软骨素酶提取；

第一步，初次提取，将所得发酵液置于离心机中，5℃、4300r/min离心30min至35min,弃去菌体沉淀，冰浴，在磁力搅拌器的搅拌下，缓缓向发酵上清液中加入硫酸铵至92%的饱和度，5℃层析柜中静置24小时；

第二步，再次提取，将所得发酵液置于离心机中，5℃、4500r/min离心30min至35min,弃去菌体沉淀，冰浴，在磁力搅拌器的搅拌下，缓缓向发酵上清液中加入硫酸铵至92%的饱和度，5℃层析柜中静置24小时；

第三步，精细提取，然后5℃、5000r/min再次离心发酵液，收集蛋白沉淀，利用三蒸水溶解并置于透析袋中，于5℃层析柜中透析脱盐，在(NH4)2SO4溶液检测透析袋外液体不含SO42-的情况下，冷冻干燥；

步骤四：对提取的硫酸软骨素酶酶解超滤；

第一步，加入软骨投料，向步骤一中滤液加入步骤三第三步制作的硫酸软骨素酶粉，在pH值为8至10，温度为55℃至60℃的条件下酶解2小时至4小时；

第二步，搅拌脱水处理，利用搅拌机对酶解后的原料进行搅拌的5分钟至10分钟，接着在室温下用截留分子量为8100的超滤膜超滤脱水浓缩至原体积的2/3；

第三步，废料处理，利用超滤膜脱水排出的液料放入导储存箱内进行暂存；

步骤五：制作硫酸软骨素并消毒；

第一步，初步制作，将超滤脱水后的浓缩液调pH值为8-9，加入为软骨投料重量4％至6%的双氧水，在温度为36℃至45℃的条件下氧化2小时至4小时过滤，滤液调pH值为5至6，加入96％乙醇结晶，使乙醇浓度达76%至80%；

第二步，离心洗涤处理，结晶后利用离心机进行离心以及洗涤；

第三步，干燥封装消毒处理，洗涤后晾干得到鱼硫酸软骨素，利用封装设备将软骨素包装，同时利用紫外线消毒设备对包装外部进行照射消毒。

2.如权利要求1所述的新的提取鱼软骨中硫酸软骨素的方法，其特征在于，在步骤一中，所述的加入7%至9%的氢NaOH溶液和氯化钠溶液。

3.如权利要求1所述的新的提取鱼软骨中硫酸软骨素的方法，其特征在于，所述的在温度为65℃至75℃的条件下提取2小时至4小时。

4.如权利要求1所述的新的提取鱼软骨中硫酸软骨素的方法，其特征在于，所述的用无菌水将土样悬浮制成12%至20%的土壤溶液。

5.如权利要求1所述的新的提取鱼软骨中硫酸软骨素的方法，其特征在于，在步骤二中，所述的利用多层滤纸抽滤后使液体澄清，多层可设置为3层或5层。