[发明专利]一种毕赤酵母EHT1基因过表达及敲除菌株构建的实验方法

说明书

本发明适用于基因作用机制检测的技术领域，提供了一种毕赤酵母EHT1基因过表达及敲除菌株构建的实验方法，通过构建毕赤酵母的EHT1基因表达菌株、设计和合成EHT1引物、提取毕赤酵母菌体的质粒、线性化质粒及制备毕赤酵母感受态、构建敲除EHT1基因的毕赤酵母菌株、EHT1基因的敲除和转化、鉴定毕赤酵母EHT1基因是否敲除、设计及合成EHT1检测引物、利用qRT‑PCR检测EHT1的mRNA、SPME GC‑MS酶活性分析，从而检测EHT1基因对于毕赤酵母发酵产物中挥发性脂肪酸的产生的作用，为进一步研究醇酰基转移酶的表达和酯酶活力，揭示毕赤酵母EHT1基因作用机制提供理论依据。

技术领域

本发明属于基因作用机制检测的技术领域，尤其涉及一种毕赤酵母EHT1基因过表达及敲除菌株构建的实验方法。

背景技术

HT1对短链脂肪酸酯的合成起到更大的控制作用。对从各种食品中分离到的酵母菌株进行挥发性香气成分检测，发现可以产生多种酯类物质如辛酸乙酯和己酸乙酯等。分析酵母中控制酯类合成的酶发现EHT1和EEB1主要控制中短链的脂肪酸酯，前期研究EHT1和EEB1基因的分布发现EHT1基因在所有菌株中均存在，而EEB1基因只在部分酵母菌株中存在，推测EHT1基因是酵母合成酯类所必需基因。因此，通过过表达(OE)和敲除毕赤酵母内源性EHT1基因，检测EHT1的mRNA和蛋白水平表达，Bradford法测定总蛋白量，对硝基苯基乙酸酯作为底物测定酯酶活性，SPME GC-MS检测过表达和敲除菌株中挥发性脂肪酸的产生，从而为进一步研究醇酰基转移酶的表达和酯酶活力，揭示毕赤酵母EHT1基因作用机制提供理论依据。

发明内容

本发明提供一种毕赤酵母EHT1基因过表达及敲除菌株构建的实验方法，旨在为进一步研究醇酰基转移酶的表达和酯酶活力，揭示毕赤酵母EHT1基因作用机制提供理论依据。

本发明是这样实现的，一种毕赤酵母EHT1基因过表达及敲除菌株构建的实验方法，包括以下步骤：

S1、构建毕赤酵母的EHT1基因表达菌株；

S11、设计和合成EHT1引物；

S12、提取毕赤酵母菌体的质粒；

S13、线性化质粒及制备毕赤酵母感受态；

S14、电转化EHT1/pPIC9k质粒；

S2、构建敲除EHT1基因的毕赤酵母菌株；

S21、EHT1基因的敲除和转化；

S22、鉴定毕赤酵母EHT1基因是否敲除；

S23、设计及合成EHT1检测引物；

S24、利用qRT-PCR检测EHT1的mRNA；

S25、SPME GC-MS酶活性分析。

优选的，还包括：

步骤S3、结果分析；

S31、克隆EHT1基因和构建质粒；

S32、鉴定EHT1基因敲除DNA的水平；

S33、检测EHT1过表达及敲除mRNA水平；

S34、检测EHT1过表达敲除蛋白水平；

S35、测定酯酶活性；

S36、SPME GC-MS分析。