[发明专利]一种山苍子组织培养方法

说明书

本发明公开的一种山苍子组织培养方法，包括以下步骤：以山苍子春稍带芽茎段为外植体，经预处理、消毒后，进行节杆菌属内生菌检测，筛选出外植体组织中无节杆菌属内生菌的外植体进行后续培养。本发明提供的山苍子组织培养方法通过在培养前进行外植体中节杆菌属内生菌的检测，以便选取无内生菌的外植体进行后续培养，从而极大的减少了人力、物力的浪费，提高了山苍子离体快繁的效率，促进了山苍子产业的发展。

技术领域

本发明涉及植物组织培养和离体快繁技术领域，更具体地，涉及一种山苍子组织培养方法。

背景技术

山苍子(Litsea cubeba)是我国南方特有的工业原料和香料树种，其果实提炼的精油中柠檬醛含量极高，被广泛应用于医药、食品、化妆品等领域。建立山苍子的组培快繁体系，不仅能促进山苍子产业的发展，也可为山苍子的基础研究奠定基础。

现有技术中，在将山苍子带芽茎段作为外植体进行组织培养的过程中，时常出现外植体生长异常甚至死亡的情况，这严重制约了山苍子离体快繁的效率。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种山苍子组织培养方法，该方法通过在培养前进行外植体中节杆菌属内生菌的检测，以便选取无内生菌的外植体进行后续培养，从而极大的减少人力、物力的浪费，提高山苍子离体快繁的效率，促进山苍子产业的发展。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种山苍子组织培养方法，包括以下步骤：以山苍子春稍带芽茎段为外植体，经预处理、消毒后，进行节杆菌属内生菌检测，筛选出外植体组织中无节杆菌属内生菌的外植体进行后续培养。

优选的，所述预处理包括以下步骤：将所述外植体用洗洁精或洗衣粉洗涤后再置于流水下冲洗8-10小时，随后置于4-6℃的低温中处理8-12小时。

优选的，所述消毒包括以下步骤：在无菌操作台内，将预处理完成后的外植体置于75％的乙醇中消毒10-15秒后，用无菌水冲洗4-5次，再置于0.1％的升汞溶液中消毒5-7分钟，随后同样用无菌水冲洗4-5次，再置于无菌水中备用。

优选的，所述节杆菌属内生菌检测包括以下步骤：

在消毒后的外植体上剪取多片茎段组织碎片，置于DNA提取液中，室温静置，得到DNA粗提液；

将所述DNA粗提液与显色反应液、引物A、引物B、10000×SYBR Green I荧光染料、去离子水混合形成反应体系，进行等温扩增反应，所述引物A的序列为GGTTGTAACCTCTTTCAGTAGGGAAGAAGC，所述引物B的序列为ATTCCAGTCTCCCCTACATCACTCTAGTCT；反应完成后，检测是否存在扩增产物，若存在，则外植体组织中存在节杆菌属内生菌。

优选的，每个所述茎段组织碎片的厚度不超过1mm，总的所述茎段组织碎片与所述DNA提取液的质量体积比为0.6-1g：1ml。

优选的，所述室温静置的时间为10-15min。

优选的，所述DNA提取液中包括以下终浓度的各组分：中包括以下终浓度的各组分：20-30mmol/l的氢氧化钠、5-10％的PEG 200和5％的抗氧化液；其中，所述抗氧化液中含有5-10％的二甲基亚砜和2-4‰的虾青素。

优选的，所述显色反应液中包括以下终浓度的各组分：80-100ng/μl的SSB蛋白、100-120ng/μl的recA重组酶蛋白、20-40ng/μl的Bst DNA聚合酶、80-120mmol/l的Tricine、80-120mmol/l的醋酸镁，5-10mmol/l的二硫苏糖醇，5-10％的PEG 2000，2-6mmol/l的ATP，80-100ng/μl的肌酸激酶，180-220μmol/l的dNTP和5-10％的抗氧化液，其中，所述抗氧化液中含有5-10％的二甲基亚砜和2-4‰的虾青素；所述Tricine的pH为8.0。