[发明专利]一种T7RNA聚合酶和T7启动子的表达系统及使用其在真核生物中表达蛋白质的方法

说明书

本申请涉及一种T7 RNA聚合酶和T7启动子的表达系统及使用其在真核生物中表达蛋白质的方法。所述表达系统包含HIV‑1逆转录病毒中的Vpu蛋白和/或Rev‑RRE调控元件，该系统可使真核生物中T7转录的无5′cap结构的mRNA跨核膜运输到细胞质，从而实现连续稳定高效地表达外源蛋白。

技术领域

本申请涉及一种基于HIV-1的Vpu和Rev-RRE元件的T7 RNA聚合酶(T7 RNAP)和T7启动子表达系统，该表达系统可用于在真核细胞中持续稳定高效地表达蛋白。

背景技术

T7表达系统已被广泛地应用于蛋白质的表达，其中在原核生物中的应用最为普遍(参见，专利文献1)。最典型的代表是Novagen公司研发的pET系列质粒，这类质粒目前已被广泛地应用在大肠杆菌中高效地表达蛋白质。

对于真核生物，有研究者利用酵母菌株开展了T7表达系统的研究，但却没有得到积极的结果，只检测到T7 RNAP的表达，没有检测到T7启动子控制的目的蛋白的合成(参见，非专利文献1和2)。

还有研究者在哺乳动物细胞中以病毒(如牛痘病毒)作为载体构建存在于细胞质中的T7表达系统，存在于细胞质中的牛痘病毒载体会随着细胞分裂而丢失；同时，大量复制的牛痘病毒最终也会杀死宿主细胞。因此，该T7表达系统只能实现蛋白质在细胞质中的瞬时表达，难以实现持续稳定地表达目标蛋白(参见，非专利文献1和3)。

为实现真核细胞内持续稳定地表达蛋白质，关键点在于将细胞核内转录后再加工的真核mRNA通过核膜成功转运至细胞质，然后才能实现mRNA在细胞质内翻译成蛋白质。但是，由于细胞核内T7 RNAP转录出的mRNA没有5′帽子结构和3′poly(A)尾巴，不能被运输出细胞核，因此影响了细胞质内蛋白质的翻译合成，不能高效表达蛋白质。

对于T7 RNAP转录的缺乏5′cap结构的mRNA，有研究发现，在细胞质内利用IRES结构可以帮助缺乏5′cap结构的真核生物mRNA翻译合成蛋白质(参见，非专利文献4)，但是，该研究并未涉及细胞核内的T7 RNAP转录的缺乏5′cap结构的mRNA运输到细胞质的问题。同样，还有研究表明，在T7启动子启动的转录单元中添加真核生物终止子序列可以帮助T7RNAP转录产物产生3′poly(A)尾巴(参见，非专利文献5)，但是该研究也未解决如何将缺乏5′cap结构的mRNA从细胞核运输到细胞质的问题。

现有技术文献：

专利文献1：CN102643851A

非专利文献1：ELROY-STEIN O,FUERST T R,MOSS B.Cap-independenttranslation of mRNA conferred by encephalomyocarditis virus 5'sequenceimproves the performance of the vaccinia virus/bacteriophage T7 hybridexpression system[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,1989,86(16):6126-30.

非专利文献2：Benton B M,Eng W-K,Dunn J J,et al.Signal-mediated importof bacteriophage T7 RNA polymerase into the Saccharomyces cerevisiae nucleusand specific transcription of target genes[J].Molecular and Cellular Biology,1990,10(1):353-60.

非专利文献3：Wang W,Li Y,Wang Y,et al.Bacteriophage T7 transcriptionsystem:an enabling tool in synthetic biology[J].Biotechnology Advances,2018.