[发明专利]TrFQR1基因及其克隆、表达载体构建方法和应用

说明书

本发明公开了提供一种能够提高白花三叶草生长过程中对高温和干旱的抗逆能力，同时可以增加其须根数量的TrFQR1基因。该TrFQR1基因的cDNA全长序列如序列表SEQUENCE ID NO.1所示。通过荧光定量PCR验证了TrFQR1在高温，干旱胁迫下的表达模式，结果表明该基因在高温和干旱胁迫下，TrFQR1基因在根与叶中的表达量均发生了显著的变化，各胁迫条件及时间点下有所差异，能够有效提高白花三叶草生长过程中对高温和干旱的抗逆能力，将TrFQR1基因通过基因工程的手段转入到拟南芥中，转基因植株较野生型的须根数量显著增加，说明TrFQR1具有促进植物根系生长的作用。适合在生物技术领域推广运用。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种TrFQR1基因及其克隆、表达载体构建方法和应用。

背景技术

白三叶(Trifolium repens)作为一种广泛栽培的豆科牧草，品质优良，为多种畜禽所喜食。其匍匐茎发达、生长低矮、生长适应性和扩展能力强、再生速度快，竞争能力强，也作为温带地区观赏性草坪和绿地建植的主要草种，在国内外城镇绿化、水土保持等方面起着发挥重要作用。然而，白花三叶草虽然品质好，但产量有待提高；且白三叶喜冷凉湿润的气候，根系生长短，调控蒸腾能力差，因此抗旱性较弱，不耐高温，在栽培种植过程中经常会因干旱和高温胁迫抑制白三叶的生长。近年来，受全球气候变暖的影响，部分地区降雨偏少或降雨分布不均影响了白三叶的生长和利用。因此，发掘提高白三叶抗旱及耐热相关基因并进行功能验证将为提高白三叶产量及其抗逆性奠定重要基础。

TrFQR1属于依赖FMN的还原酶家族，即是一个以FMN(flavin mononucleotide)为辅基且依赖于NADPH的醌氧化还原酶家族蛋白[FMN-dependent NADPH quinone reductasefamily(FMN_red)。FMN是黄素蛋白的辅基，参与氧化还原反应、催化脱氢、氧化和电子转移或羟基化过程，在呼吸等生物氧化过程的电子传递中具有重要作用。醌作为一种自然界中广泛存在的有毒物质，能诱发哺乳动物细胞癌变和坏死。NAD(P)H：醌氧化还原酶能减少醌类转化可能引起的细胞器及遗传物质损伤，保证机体的正常生理功能，因而受到广泛关注。已有研究表明，该类基因及其相关产物与人类多种疾病的发生有着紧密的关系，对于醌类物质能起到解毒的作用。因此，对白三叶TrFQR1基因克隆及功能验证具有重要的理论意义与实际价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种能够提高白三叶生长过程中对高温和干旱的抗逆能力，同时可以增加其须根数量的TrFQR1基因。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案为：该TrFQR1基因的cDNA全长序列如序列表SEQUENCE ID NO.1所示。

进一步的是，所述TrFQR1基因编码的蛋白，其氨基酸序列如序列表SEQUENCE IDNO.2所示。

本发明还提供了一种TrFQR1基因的克隆方法，其克隆方法包括以下步骤：

1)、材料选择：选取白花三叶草种子，将选取的种子经75％酒精和1％次氯酸钠消毒后用Hoagland全营养液水培于光照培养箱中12h光照(23℃)，12h无光(19℃)，相对湿度75％，光照强度250umol·m^-2·s^-1，培养30d；

2)、白花三叶草总RNA的提取：首先，取步骤1)得到的白花三叶草叶片，然后采用RNAprep Pure植物总RNA提取试剂盒提取白花三叶草叶的RNA；

3)、cDNA的合成；首先，在微型管中配制反应混合液，随后42℃反应2min，冰上迅速冷却，所述反应混合液体系如表1所示：

表1反应混合液体系表