[发明专利]一株赛拉嗪单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用

说明书

一株赛拉嗪单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测技术领域。本发明赛拉嗪单克隆抗体杂交瘤细胞株ABC09，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏日期2019年11月28日，保藏编号CGMCC No.19162。首先合成赛拉嗪半抗原，再制备赛拉嗪完全抗原，并将它免疫BALB/c小鼠，取高效价、低IC₅₀小鼠脾细胞，通过PEG方法与骨髓瘤细胞融合，经过间接竞争酶联免疫法的筛选和三次亚克隆，得到杂交瘤细胞株。此细胞株分泌的单克隆抗体，对赛拉嗪具有较好的特异性和检测灵敏度（IC₅₀为0.39ng/mL）。本发明成果可用于建立乳品和其他含有赛拉嗪的食品中赛拉嗪含量的免疫检测方法，具有实际应用价值。

技术领域

本发明涉及一株赛拉嗪单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测技术领域。

背景技术

赛拉嗪（Xylazine，XYL）为镇痛性化学保定药，主要用于马、牛、羊等动物的镇静与镇痛。研究表明，赛拉嗪在食源性动物组织中的残留对消费者造成的健康风险很大，长期使用含有赛拉嗪残留动物源食品可能会出现恶心、呕吐、头晕，个别患者会出现精神失常。因此，建立有效的赛拉嗪残留检测方法，对有效控制牛奶产品中赛拉嗪的残留，保障广大人民群众的身体健康，具有深远的意义。

赛拉嗪的传统检测方法有高效液相色谱，液相色谱/串联质谱和气相色谱/串联质谱等，然而这些方法的前处理比较复杂、费时，不适用于大量样品的快速检测，为了维护广大消费者的利益，有必要建立一种针对赛拉嗪的高效、快速的检测方法。酶联免疫法（ELISA）是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，检测时对样本的纯度要求不高而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测，然而，使用酶联免疫法检测赛拉嗪的前提是得到对赛拉嗪具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体，因此，找到一种制备对赛拉嗪具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体的方法十分关键。

发明内容

本发明的目的是提供一株赛拉嗪单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，由该细胞株制备的抗体对赛拉嗪具有较高的检测灵敏度，可以用来建立赛拉嗪的免疫学检测方法。

本发明的技术方案，一株赛拉嗪单克隆抗体杂交瘤细胞株ABC09，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年11月28日，保藏编号CGMCC No.19162。

赛拉嗪单克隆抗体，它由所述保藏编号为CGMCC No.19162的赛拉嗪单克隆抗体杂交瘤细胞株ABC09分泌产生。

免疫原赛拉嗪-BSA的合成，具体步骤如下：

（1）赛拉嗪半抗原的制备：将赛拉嗪（570 mg，2.59 mmol）和1,5-戊二酰氯（480.99mg，2.85 mmol）溶于二氯甲烷（5 mL），并在冰浴中冷却。然后将溶解在二氯甲烷（5mL）中的三乙胺（TEA）（314.18mg，3.10mmol）添加至所述溶有赛拉嗪的混合液中。添加30min后，温度逐渐升至室温。通过薄层色谱法（TLC）证明原料已被消耗。将反应混合物在真空中浓缩，并通过快速柱色谱法纯化（DCM：MeOH，1：0逐渐增加至40：1），得到化合物1（660 mg，1.70mmol，产率65.60％（w / w））。将化合物1（660 mg，1.70mmol）溶于N，N-二甲基甲酰（3mL）。然后将溶液加入水（3 mL）中，在其中白色固体会分离出来。过滤收集产物，随后用DCM洗涤3次，并在真空下干燥。产生的白色固体即为赛拉嗪半抗原（412mg，1.23mmol，产率72.65％（w/ w））。半抗原合成路线详见实施例1杂交瘤细胞株ABC09的制备。