[发明专利]一种基于RGO-Hemin/Au NPs纳米复合材料检测GPC3的方法

说明书

一种基于RGO‑Hemin/Au NPs纳米复合材料检测GPC3的方法，采用电沉积技术以及静电吸附作用将RGO‑Hemin/Au NPs修饰在丝网印刷电极表面。将GPC3‑Apt负载在RGO‑Hemin/Au NPs材料表面，适配体因以单链结构的形式而呈不稳定的空间结构分布在生物传感界面上。在生物传感界面中加入GPC3后，GPC3能够与GPC3‑Apt特异性结合形成蛋白‑适配体复合物而呈稳定的空间结构，从而有序排列在工作电极上。通过DPV方法检测电流值响应值，并描绘出该电流响应值与GPC3浓度的关系曲线，实现对GPC3的定量检测。该方法操作简单、省时、费用低且具有较低的检测限。

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种基于电化学生物传感器检测磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3（GPC3）的方法。

背景技术

磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3（GPC3）是在研究过度生长综合征（SGBS）时发现的，是硫酸乙酰肝素糖蛋白中的一种。GPC3在人的正常的肝细胞中无表达，在其他肿瘤组织也低表达或无表达，而在肝癌组织中表达显著高于癌旁组织。GPC3检测方法主要有放射免疫分析法、荧光免疫分析法、酶联免疫吸附法、化学发光免疫分析法、流式免疫分析法、电化学免疫传感器、压电免疫传感器及多肽复合蛋白微阵列等。公开号CN 106636108 A的发明专利，涉及一种靶向GPC3的核酸适配体及其应用，利用结合毛细管电泳的SELEX技术筛选与肝癌标志物GPC3特异性结合的核酸适配体，获得具有特异结合GPC3的适配体序列G625。所述的GPC3核酸适配体可用于设计、制备肝癌血清诊断试剂、肝癌组织切片染色试剂以及肝癌相关的活体成像造影剂。公开号CN 105717104 A的发明专利，涉及一种肝细胞癌患者外周血GPC3检测方法：利用膜过滤装置分离获取无法获得组织标本的肝癌患者外周血中的CTC，运用细胞蜡块技术制作薄层切片，进而检测GPC3表达情况。申请号为CN101290318的发明专利，公开了一种肝癌的检测试剂盒，所述检测试剂盒中含有结合硫酸肝素蛋白多糖3第379-393位中的抗原表位的多克隆抗体，以及结合硫酸肝素蛋白多糖3第379-393位以外抗原表位的单克隆抗体或多克隆抗体，在检测AFP标志物的同时采用本发明的试剂盒检测GPC3标记物可显著提高肝癌的诊断敏感性。这些方法所用仪器昂贵、操作复杂、费时且技术要求高，所以需要建立一种快速、灵敏、操作简便的GPC3检测方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种基于还原性氧化石墨烯-血红素/金纳米复合材料（RGO-Hemin/Au NPs）结合适配体来检测GPC3的方法，提高灵敏度、增强特异性。

为了解决该技术问题，采用电沉积技术以及静电吸附作用制作了基于RGO-Hemin/Au NPs的GPC3适配体电化学生物传感器。利用石墨烯及纳米金对GPC3适配体（GPC3-Apt）的高负载能力和良好的电子传递效应，以及GPC3-Apt对GPC3的特异性识别作用，采用电化学工作站的微分脉冲伏安法 (DPV)，记录其峰电流。对GPC3的孵育温度、孵育时间、PBS的pH值、GPC3-Apt浓度和复合材料的量进行了优化，绘制了标准曲线，通过与标准工作曲线对比得到准确的GPC3浓度。与现有的方法相比，操作相对简单，特异性高，时间和费用的消耗更少，能达到2.86 ng/mL的检测限。

本发明的检测原理为：在硫酸活化预处理后的丝网印刷电极上修饰沉积上一层金纳米粒子，利用金的吸附作用将制备好的RGO-Hemin复合材料固定在修饰好的电极上，接着通过分子间作用力将GPC3-Apt固定在RGO-Hemin/Au NPs的表面，构建适配体传感界面，此时适配体因以单链结构的形式而呈不稳定的空间结构分布在生物传感界面上。而后将GPC3蛋白导入到上述生物传感界面，因GPC3蛋白能与GPC3适配体发生特异性结合形成蛋白-适配体复合物而呈稳定的空间结构，从而有序排列在电极表面。通过电化学工作站，使用循环脉冲伏安法（DPV）检测Hemin的电流响应信号变化值。

本发明按照以下步骤进行：

步骤1：RGO-Hemin材料的制备