[发明专利]一种钩端螺旋体黏附蛋白rvWFA3-2的制备方法和应用

说明书

一种钩端螺旋体黏附蛋白rvWFA3‑2的制备方法和应用，属于分子生物学和免疫学技术领域。其通过基因工程手段构建了vWFA3‑2蛋白编码基因的原核表达系统，诱导纯化获得重组蛋白rvWFA3‑2，其可用于疫苗研发、钩端螺旋体感染抗体检测试剂盒研发。本发明采用生物信息学分析证实了LA_4207基因产物N端有信号肽分泌型蛋白，LA_4207基因产物含有超家族结构域（34‑200aa）。提供了一种新方法用于体外制备重组蛋白rvWFA3‑2。并证明了制备得到的黏附蛋白rvWFA3‑2对致病问号钩端螺旋体菌株的攻击起到保护作用，产生高效价保护性抗体，且具有交叉保护作用。

技术领域

本发明属于分子生物学和免疫学技术领域，具体涉及一种钩端螺旋体黏附蛋白rvWFA3-2的制备方法和应用。

背景技术

侵袭力决定了微生物能否感染宿主，感染则是发病的先决条件，故侵袭力成为近年病原微生物致病机制的研究重点。众所周知，侵袭力的主要物质基础是和侵袭性酶类，黏附是病原微生物致病的第一步，其本质是病原微生物黏附因子配体与宿主细胞受体结合的过程，使得病原微生物能在宿主体内定植，然后生长繁殖引起疾病。

接种疫苗是预防和控制传染病最为有效和经济的手段。基因工程疫苗因生产成本低、效果好而成为疫苗研究的重要方向。钩端螺旋体外膜蛋白被证明具有属特异性的抗原，我们在前期研究中也证明外膜蛋白质LipL21、LipL32和 LipL41等及其表位抗原具有一定的免疫保护性，可以作为疫苗候选抗原，但仍未得到满意的免疫效果。位于外膜的黏附因子，不仅与细菌的侵袭作用密切相关，同时还可诱导机体产生具有免疫保护作用的血清IgG抗体。

血友病因子(von Willebrand factor，vWF)是人及哺乳动物血管内皮细胞及巨核细胞合成并分泌的一种糖蛋白，可与血小板膜糖蛋白GpIb和GpIIb-Ⅲa结合，引发血小板黏附和聚集。vWF是重要凝血因子，有12个功能区，其中A3区与血管损伤后暴露的基底膜胶原蛋白(collagen，COL)结合使血小板局部聚集，推测可能与黏附功能相关。

发明内容

针对上述现有技术中存在的问题，本发明通过生物信息学分析发现LA_4207 基因编码产物具有vWFA3区超家族结构域vWFA3-2，但无血小板GP-Ib受体结合位点，我们推测vWFA3-2在问号钩体感染过程中发挥黏附因子作用。采用基因工程手段构建了vWFA3-2蛋白编码基因的原核表达系统，诱导纯化获得重组蛋白rvWFA3-2，并证明其作用与应用。

一种钩端螺旋体黏附蛋白rvWFA3-2的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)根据问号钩端螺旋体赖株LA_4207基因限制性核酸内切酶图谱分析、信号肽预测结果以及T-A克隆、亚克隆载体pET42a多克隆位点，设计含核酸内切酶Nde I或Xho I酶切位点的PCR引物，备用；

(2)提取问号钩端螺旋体赖株DNA；

(3)采用步骤(1)得到的PCR引物和步骤(2)得到的问号钩端螺旋体赖株DNA，扩增LA_4207基因中凝血因子A3区超家族结构域片段，得到目的基因扩增片段，以溴乙锭预染色的1.5％琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段后，采用T-A 克隆试剂盒将上述目的基因扩增片段与pMD19-T连接，连接过夜后采用氯化钙法将质粒转化入感受态E.coli DH5α形成E.coliDH5α^pMD19-T4207，蓝白筛选后提取重组质粒pMD19-T⁴²⁰⁷测序；

(4)将步骤(3)得到的测序结果目的基因序列正确的重组质粒pMD19-T⁴²⁰⁷与表达载体pET42a用限制性核酸内切酶Nde I和Xho I酶切后回收，在T4 DNA 连接酶作用下连接，形成重组原核表达质粒pET42a⁴²⁰⁷；