[发明专利]一种重组人胶原蛋白及其构建方法

说明书

本发明公开一种重组人胶原蛋白及其构建方法，重组人胶原蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.1：GPAGARGNDGATGAAGPPGPTGPAGPPGFP。该重组人胶原蛋白没有信号肽和跨膜结构，是一种新的亲水性蛋白，而且该蛋白没有抗原决定簇，应用于人体中不会造成免疫排斥反应。本发明还公开了该低免疫原、亲水性的重组人胶原蛋白的构建、合成方法。采用本发明合成的重组人胶原蛋白纯度高、没有病毒隐患，表达量高。该蛋白可广泛应用于生物医药、再生医学、组织工程及美容、保健、化妆品等相关产品中。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种重组人胶原蛋白及其构建方法。

技术背景

胶原蛋白是哺乳动物体内含量最丰富的蛋白质，约占蛋白质总量的30%，广泛存在于动物皮肤、软骨、血管等组织和器官中，参与生物体的生长、发育和细胞分化、粘附及抗原抗体结合反应等重要的生命过程。迄今为止，在脊椎动物和高等无脊椎动物中发现了28种不同类型的胶原蛋白。在这些胶原类型中，I型胶原在脊椎动物中最为丰富，它以不同的比例与其他分子结合，形成各种组织支架，如基底膜、韧带、肌腱、皮肤和血管，使它们机械强度高。

胶原最典型的结构是由三股螺旋结构的肽链缠绕形成的纤维状蛋白，三股螺旋分子的有序聚集使其分子结构很稳定且纤维具有很好的韧性，同时这种三股螺旋结构可使胶原的机械强度更好。胶原蛋白的一级结构的氨基酸排列呈现出“甘氨酸-X-Y（X、Y是甘氨酸之外的任意氨基酸）”周期规律。

胶原蛋白因其具有低免疫原性、良好的生物相容性、生物可降解性等优良的生物学特性而被广泛地应用于食品、制药和化妆品行业等领域。近年来，胶原蛋白已在医学上得到了广泛的应用，以膜、海绵、注射液、栓塞等形式作用于美容、矫形、烧伤、创伤、硬组织修复等方面。然而，天然的胶原蛋白不溶于水，而且从动物体内提取的胶原蛋白的性质不均一，很难进一步加工。目前，生产胶原蛋白主要是通过酸法、碱法及各种酶解的方法从猪皮、牛皮或鱼皮等动物的结缔组织中提取获得，但动物来源的胶原蛋白存在许多病毒隐患，而且作用于人体会产生异种排斥反应；其次，利用化学方法合成的胶原蛋白无法避免会丧失生物活性，并且技术较为复杂，提取方法污染重，成本高，因此大大限制了胶原蛋白在医药等诸多领域的应用。

随着现代分子生物学的快速发展，人们开始把目光转向利用基因工程技术，利用各种宿主细胞，如昆虫、转基因鼠、大肠杆菌等来生产重组人胶原蛋白。例如西北大学的范代娣等应用大肠杆菌高密度发酵培养生产人源性胶原蛋白，但蛋白表达量只有不到30%，而且细菌表达体系具有内毒素、热源等生物安全问题，且表达产生的蛋白质常以包涵体形式存在，纯化比较困难，产物不纯，难以应用于临床。因此，现在越来越多的学者开始利用巴氏毕赤酵母工程菌经发酵培养重组人胶原蛋白，虽然具有无致热源、产物可胞外分泌等优点，但是，同样存在着很多不足，如发酵周期长、生产效率较低、纯度不高等问题。因此，在制备重组人源胶原蛋白的技术领域，亟需开发一种纯度高、安全性高、得率高、周期短、亲水性强、易于大规模生产的方法；而且为了更好地应用临床，避免对人体会产生排斥反应，需要开发一种低免疫原的重组人胶原蛋白。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种重组人源胶原蛋白及其构建方法，该重组人源胶原蛋白肽段短，可以直接合成，适合大规模制备，操作简单、水溶性好，未发现抗原决定簇。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

第一方面，提供一种重组人源胶原蛋白，氨基酸序列为SEQ ID NO.1，其序列如下：

GPAGARGNDGATGAAGPPGPTGPAGPPGFP。

其中，所述重组人胶原蛋白的结构为单链、单螺旋结构，呈现胶原的序列特征“甘氨酸-X-Y（X、Y是甘氨酸之外的任意氨基酸）”，全长为30个氨基酸，为人胶原蛋白I型肽段。

其中，所述重组人胶原蛋白的分子量为2526.71Da，理论等电点为5.84。