[发明专利]副溶血性弧菌的PMA-qPCR检测方法

权利要求书

1.一种副溶血性弧菌的PMA-qPCR检测方法，其特征在于，所述检测方法采用PMA对菌液预处理后提取菌体DNA，再进行qPCR扩增，根据荧光数据的Ct值判断检测结果。

2.根据权利要求1所述的副溶血性弧菌的PMA-qPCR检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：

1）利用PMA对菌液进行预处理，使PMA与死亡或细胞膜损伤菌体DNA交联；

2）提取菌体DNA；

3）采用特异性引物对步骤2）提取的DNA模板进行qPCR扩增，采用的引物和探针的序列如下：

上游引物toxR-F：5’-AACGATCGTAGAGCCGTCTT-3’

下游引物toxR-R：5’-CTCACCAATCTGACGGAACTG-3’

探针toxR-P：FAM-5’-ACGCAATCGTTGAACCAGAAGCGCCA-3’–TAMRA；

4）采集荧光信号，得到qPCR产物的Ct值，Ct值≤35的样本为阳性，Ct值显示为无的样本为阴性；35＜Ct值≤40，判为可疑样品，对于可疑样品，先看扩增曲线，如果扩增曲线为对数扩增曲线，则为可疑阳性，否则判为阴性；对于可疑阳性样品，重新提取核酸进行检测，如果重复扩增曲线为对数扩增曲线，判为阳性，否则判为阴性。

3.根据权利要求2所述的副溶血性弧菌的PMA-qPCR检测方法，其特征在于，步骤1）具体为：样品接种至碱性蛋白胨水中，36℃振荡孵育6h-18h，菌液离心后用PBS缓冲液洗涤2-3次后菌重悬于PBS中，在避光条件下向重悬菌液中加入PMA工作液，使其终浓度为4μM，充分混匀后，避光处理、间隔振动，再置于40w光照强度下照射3min。

4.根据权利要求2所述的副溶血性弧菌的PMA-qPCR检测方法，其特征在于，所述qPCR扩增反应条件为：95℃预变性30sec，每个循环为：95℃，5sec；60℃，34sec；40个循环。