[发明专利]一种有机铜饲料添加剂的制备方法

说明书

本发明提供一种有机铜饲料添加剂的制备方法，本发明选用经过耐铜驯化后的菌种乳酸菌（LB014）、粪肠球菌（E2）和枯草芽孢杆菌（JIN8），通过建立复配关系，然后接种于一定铜浓度的发酵培养基中，利用实时在线监测培养基成分变化，结合营养素流加技术和分段控速发酵技术，从而制备一种生物产量大、铜富集量高及有机化高的有机铜饲料添加剂。本发明制备的有机铜饲料添加剂铜含量4.28%，其中有机铜含量占总铜含量的63.1%，可用于仔猪、繁殖母猪、肉仔鸡、产蛋鸡等的铜补充剂，在添加比例为NRC标准（1994）的60%~80%时，其应用效果优于五水硫酸铜按照NRC标准（1994）100%添加量的效果。

技术领域

本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一种有机铜饲料添加剂的制备方法。

背景技术

铜是生命体必需的微量元素之一。由于一般食物中铜利用率较低，难易满足需求，额外补充一定量铜制剂是预防铜缺乏的重要措施。制备一种高效、低毒的铜制剂是有效补充铜，减少铜中毒，降低铜污染的保障。利用特定微生物对铜的富集特性来生产稳定态或合成态铜是有机铜制剂生产的潜在途径之一。有专利曾利用酵母菌，通过耐铜菌株筛选、化学诱变从而获得高耐铜菌株，进而利用高耐铜菌株在铜浓度为10µg/mL培养液中发酵，生产富铜酵母产品。该方法为低铜浓度发酵，产品含铜量低，仅为每千克酵母含铜1052毫克，势必造成该产品在生产中添加量过大，相应成本增加。也有专利通过利用富铜培养基筛选已知微生物，获得耐铜菌株（地衣芽孢杆菌），进而利用该菌株对铜含量为0.85%的固体培养基进行发酵，生产一种发酵态铜饲料添加剂。该技术获得的铜制剂为物料混合体，难易确定微生物铜富集率，从而难以保障铜的有机化率，不好制定产品标准；现有专利有利用啤酒酵母和产朊假丝酵母联合于1200mg/L铜浓度的液体培养基中进行发酵以生产一种酵母发酵态铜饲料添加剂。该专利采用高浓度发酵，产品富铜较高，每公斤酵母含铜7.58克，但其生产过程复杂，需要分阶段添加铜源，发酵耗时长，为36h。

从以上发明专利来看，存在如下问题：（1）采用单菌，低浓度发酵，产品铜含量低，生产添加量大，成本高；（2）采用固体发酵方式，虽可以在高浓度下发酵，但产品品质不好控制，尤其是微生物富铜率不确定，难以制定产品标准；（3）两种酵母菌联合，高浓度发酵，产品铜含量较高，但发酵工艺复杂，耗时，不利于工业化生产。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，本发明旨在提供一种有机铜饲料添加剂的制备方法，利用已经过耐铜强化的乳酸菌（LB014）、粪肠球菌（E2）和枯草芽孢杆菌（JIN8）联合富铜，生产一种复合型生物富集态有机铜制剂，并采用生物量、铜富集量和有机化率三个指标来反映产品的生产效率，实现快速发酵、高产量、高富集量和高有机化率，以利于工业化生产和产品标准制定。

本发明为解决上述技术问题采用的技术方案是：一种有机铜饲料添加剂的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、将耐铜乳酸菌、耐铜粪肠球菌和枯草芽孢杆菌分别接种于液体培养基中，调pH至6~7，培养16~24h，获得种子液；

步骤二、将耐铁乳酸菌、耐铜粪肠球菌和枯草芽孢杆菌按体积比为2:1:2~2:1:4混合均匀，按照种子液与铜发酵培养基的体积比为0.08：1~0.12:1，将混合后的种子液接种于铜发酵培养基中，得到发酵液；

步骤三、将发酵液装入发酵罐中，发酵温度为30~40℃；搅拌频率为：在时间段为0~5h时，搅拌速率为500~600r/min；在时间段为6~12h时，搅拌速率为400~500r/min；在时间段为12-24h时：搅拌速率为300~400r/min；发酵罐中发酵液的pH每降低“0.5”，分别流加碳源、氮源和矿物质；pH每降低“1”流加氨水将发酵液的pH调至6~7；

步骤四、发酵结束后，离心获得湿微生物菌体，用轻质碳酸钙，按照湿微生物菌体和轻质碳酸钙按照质量比为1:0.5~1:2混合均匀，然后在温度为70~80℃的条件下烘干至水分为8~12%，即得有机铜饲料添加剂。