[发明专利]蛋白核小球藻细胞利用木薯渣为主要原料制备生物柴油的方法

权利要求书

1.蛋白核小球藻细胞利用木薯渣为主要原料制备生物柴油的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

步骤1）微生物混合培养：将处于对数生长期的蛋白核小球藻液和里氏木霉种子液接种到含有培养基的反应池中，蛋白核小球藻和里氏木霉的接种密度分别为1×10⁶个/ml和1×10⁷cfu/ml，温度为28℃，24小时持续光照，强度为6000Lux，转速为100rpm，发酵时间为3天，然后接入黑曲霉种子液，接种密度为5×10⁷cfu/ml，继续培养3天，培养结束后，经过离心、洗涤和冷冻干燥后，即得到粉末；所述培养基的具体组成如下：木薯渣50g/L，硝酸钠 1g/L，磷酸二氢钾 0.5g/L，氯化钠 0.1g/L，七水硫酸镁 100mg/L，氯化钙50mg/L，柠檬酸铁铵20mg/L，七水硫酸锌10mg/L；

步骤2）提取油脂：将粉末采用脉冲电场处理，电场强度20kV/cm，脉冲宽度4us，处理时间200us，然后将粉末添加到氯仿甲醇混合溶液中，添加量为1g粉末：2ml氯仿甲醇混合溶液，超声提取，提取温度为60℃，超声功率为200W，提取时间为60min，然后离心，收集氯仿相，置于氮气中吹干，并且真空干燥，得到油脂；

步骤3）制备生物柴油：油脂、脂肪酶以及甲醇按照5ml：1g：6ml的体积比添加到反应器中，催化反应12小时，然后添加占油脂两倍体积的甲醇，继续催化反应20h，终止反应，催化反应在控温为45℃的摇床中进行，摇床转速为100rpm；将反应体系的混合物离心10分钟，12000rpm，将上层液相部分移出，静置分层；取出静置分层后的下层液相，即为生物柴油粗品，再次离心10分钟，12000rpm，取出上层液相，加入2倍体积50℃的超纯水，充分搅动均匀，再次离心10分钟，12000rpm， 静置分层后得到的上层有机相，分离、取出上层有机相，即得生物柴油。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述里氏木霉种子液按照如下工艺制备而得：里氏木霉划线接种在PDA培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到一级种子培养基进行培养，然后接入二级种子培养基培养，获得里氏木霉种子液；所述一级种子培养基和二级种子培养基均为PDA液体培养基。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白核小球藻液按照如下工艺制备而得：挑取蛋白核小球藻，接种到含有生长培养基的容器中，光照强度6000lux，28℃培养，每天摇动容器2-3次，待生长至对数生长期，得到蛋白核小球藻液；所述生长培养基的组分为：葡萄糖10g/L，氯化铵 2g/L，硝酸钠 1g/L，磷酸二氢钾 0.5g/L，氯化钠 0.1g/L，七水硫酸镁 0.1g/L，氯化钙30mg/L，柠檬酸铁铵20mg/L，七水硫酸锌10mg/L，硫酸锰10mg/L。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述黑曲霉种子液按照如下工艺制备而得：将黑曲霉划线接种在斜面培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到一级种子培养基进行培养，然后接入二级种子培养基培养，获得黑曲霉种子液；所述斜面培养基组分为：马铃薯150g/L，蔗糖20g/L，琼脂15g/L；所述一级种子培养基和二级种子培养基的组分均为：玉米粉50g/L，蔗糖10g/L，硫酸铵5g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾1g/L。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述脂肪酶的酶活力为1万U/g。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述氯仿甲醇混合溶液由氯仿与甲醇按照体积比为2:1制得。