[发明专利]一种通过外周血循环肿瘤细胞检测食道鳞癌患者PD-L1基因表达的免疫荧光试剂盒

说明书

本发明提供一种通过外周血循环肿瘤细胞检测食道鳞癌患者PD‑L1基因表达的免疫荧光试剂盒，属于分子生物学领域，具体的，试剂盒主要包括：山羊血清，小鼠抗CK、大鼠抗CD45和兔抗PD‑L1基因组成的一抗混悬液，荧光标记的羊抗小鼠、荧光标记的羊抗大鼠、荧光标记的羊抗兔组成的二抗混悬液。检测方法主要包括采集外周血，处理外周血，过滤富集循环肿瘤细胞，免疫荧光方法检测循环肿瘤细胞PD‑L1基因表达情况。

技术领域

本发明提供了一种食道鳞癌患者外周血循环肿瘤细胞PD-L1基因表达的免疫荧光试剂盒，并提供检测方法，属于分子生物学技术领域。

背景技术

食管癌是世界上最常见的消化道恶性肿瘤之一，约占所有恶性肿瘤的2％。食管癌的病理类型主要包括食管鳞状细胞癌(esophageal squamous carcinoma ESCC)和食管腺癌(esophageal adenocarcinoma EADC)，在我国的食管癌患者中约90％以上均为食管鳞状细胞癌。近年来随着食管癌诊断技术的不断提高，手术操作技能的不断改进，术前新辅助化疗的应用，再加上术后规律放、化疗的施行，食管癌患者的生活质量在一定程度上逐步得到了改善，但是从整体上而言，食管癌治疗的效果仍然不尽如人意，我国食管癌患者术后的5年总体生存率仅为20％一30％。

PD-1/PD-L1为免疫靶点的免疫疗法为食道鳞癌治疗带来了新的曙光。研究发现，免疫抑制与免疫逃逸和肿瘤细胞PD-L1的过表达密切相关，肿瘤细胞可通过其表面的PD-L1与免疫细胞T细胞表面的PD-1结合，传导抑制性信号，使得T细胞不能识别肿瘤细胞和向肿瘤细胞发出攻击信号，导致了肿瘤细胞免疫逃逸。经文献检索发现，目前食道鳞癌循环肿瘤细胞PD-L1的检测国内外均未见报道。因此，检测循环肿瘤细胞(CTC)PD-L1表达情况对食道鳞癌预后及免疫治疗疗效评估具有重要价值。

循环肿瘤细胞（Circulating tumor cell，CTC）是从实体肿瘤脱落进入外周血液循环的肿瘤细胞，自1989年被发现以来，目前已有多种方法用于外周血循环肿瘤细胞的检测。近期研究表明，其检测对于评估肿瘤患者尤其是晚期肿瘤患者的预后以及选择合适的个体化治疗具有重要的临床意义。因CTC检测具有微创、实时检测等特点，被称为肿瘤的“液态活检”。

免疫荧光分析技术即将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来用以研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。由于荧光素所发出的荧光可在荧光显微镜下检出，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光(黄绿色或橘红色)，可以看见荧光所在的细胞或组织，利用定量技术测定含量，从而对抗原进行细胞定性和定位分析。

针对目前临床实践中，食道鳞癌患者PD-L1基因检测的标本主要为肿瘤组织，来源于手术或穿刺活检，很难做到多次或实时检测。因此，检测循环肿瘤细胞(CTC)PD-L1基因表达情况对食道鳞癌预后及免疫治疗疗效评估具有重要价值。

目前，山东省第一医科大学、山东省药物研究院联合山东祺欣生物科技有限公司、山东喻晓生物科技有限公司、济南杏恩生物科技有限公司、山东发现生物技术有限公司等单位，对于循环肿瘤细胞检测鉴定关键技术进行产业化推广的研究，本项目为山东省重大科技创新工程项目，本项目将以山东第一医科大学济南校区的山东省药物研究院为核心，落实注册人制度，依托循环肿瘤细胞检测鉴定核心诊断技术，进一步注册鉴定诊断试剂盒，以包括PD1、PD-L1、ER、PR、Her-2、GPC-3、VEGF、P53、Vimentin、TKI-EGFR、RAS、CK、ALK-D5F3、CD20、ALK/EML4、Beta-catenin、E-Cadherin、EP-CAM、HPV、IDH-1、PSA、PSMA、VEGF、GFAP、细胞角蛋白、AE1/AE3、雌激素受体、孕激素受体、BCA-225、CA 125、CEA、EMA、ERCC1、HPV、Ki-67、P53、TOP2A等作为CTCs表达的示踪剂，注册超灵敏、超快速、高覆盖、低成本、准确特异的鉴定诊断试剂盒，通过与在济南注册的山东祺欣生物科技有限公司、山东喻晓生物科技有限公司、济南杏恩生物科技有限公司、山东发现生物技术有限公司合作进行产业化推广。